蔬菜土壤生態(tài)系統(tǒng)微生物分子生態(tài)學(xué)研究.pdf

1、微生物在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中營養(yǎng)元素循環(huán)、有機(jī)物質(zhì)的形成和分解、土壤肥力的保持和提高、生態(tài)環(huán)境改善、植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)、作物病蟲害防治等方面起著極其重要的作用。由于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的局限性(僅有約1％的土壤微生物可人工培養(yǎng))，使人們不能全面客觀的認(rèn)識微生物的多樣性。本研究采用分子生物學(xué)技術(shù)，對蔬菜生態(tài)系統(tǒng)中有關(guān)的微生物多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果如下： 1.為探討同一區(qū)域不同栽培制度對土壤細(xì)菌多樣性的影響，應(yīng)用16S rDNAPCR-RFLP方

2、法，對菜田和水稻田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較研究，建立了兩種類型土壤細(xì)菌的16S rDNA克隆庫，對陽性克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了限制性內(nèi)切酶Hinf 1酶切片段多態(tài)性分析(RFLP)分析。在菜田土壤中共得到了75個陽性克隆和33種16S rDNA基因型，在水稻田土壤中共得到了55個陽性克隆和17種16S rDNA基因型。與水稻田土壤相比，菜田土壤具有較高的多樣性，且大多數(shù)克隆屬于Proteobacteria gamma，a

3、lpha和beta類細(xì)菌，有少部分屬于high G+C bacteria，Chloroflexus和Nitrospina類細(xì)菌。相反在水稻田土壤中大約一半的克隆屬于Proteobacteria gamma和beta類細(xì)菌，其余的屬于high G+C bacteria，Prosthecobacter和Sphingobacterium類細(xì)菌。 2.應(yīng)用18S rDNAPCR-RFLP方法，對菜田和水稻田土壤真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較研究

4、，建立了兩種類型土壤的18S rDNA克隆庫，對陽性克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了限制性內(nèi)切酶Hinf1酶切片段多態(tài)性分析(RFLP)分析。在菜田土壤中共得到了82個陽性克隆和26種18S rDNA基因型，大多數(shù)克隆屬于Ascomyta類真菌，其余屬于Basidimycota，Chytridiomycota和Zygomycota類真菌；在水稻田土壤中共得到了84個陽性克隆和23種18S rDNA基因型，大部分克隆屬于未分類真菌(

5、unclassified fungi)，其余屬于Chytridimycota，Ascomycota和Zygomycota類真菌。研究發(fā)現(xiàn)，菜田土壤真菌的辛普森多樣性指數(shù)要略高于水稻田土壤；在菜田土壤中存在水稻田土壤中未發(fā)現(xiàn)的Basidimycota類真菌；而在水稻田土壤中存在菜田土壤中未發(fā)現(xiàn)的未分類真菌。菜田土壤真菌群落多樣性要稍高于水稻田土壤。 3.采用從土壤中直接提取微生物總DNA，并用細(xì)菌16S rDNA特異性引物進(jìn)行PC

6、R擴(kuò)增、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、克隆和測序等一系列分子生物學(xué)手段，研究了不同蔬菜連作對土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，采自同一地區(qū)的土壤樣品，其DGGE圖譜的相似性很高；同時蔬菜連作對土壤中細(xì)菌的群落組成產(chǎn)生影響，這種影響同蔬菜作物種類和連作年限有關(guān)。研究結(jié)果還表明，所取土樣中的細(xì)菌大多數(shù)為Proteobacteria類細(xì)菌，另外Acidobacteria、Sphingobacteria和Actinobacteria類細(xì)菌只占

7、少量比例。 4.通過對細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增、DGGE、克隆、RFLP及測序的方法，研究分析了長期施肥條件下菜田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)長期施用有機(jī)肥與不施肥對照相比可使菜田土壤細(xì)菌多樣性有所增加，而施用無機(jī)化肥則使菜田土壤細(xì)菌的多樣性有所降低。同時長期施用有機(jī)肥和無機(jī)化肥與不施肥對照相比，可使菜田土壤細(xì)菌類群發(fā)生不同的變化：長期施用有機(jī)肥的菜田土壤，其α-Proteobacteria類細(xì)菌的數(shù)量增加很多，比對

8、照約增加15％，而γ-Proteobacteria和Sphingobacteria類細(xì)菌則有不同程度的降低，分別比對照降低約8％，δ-Proteobacteria類細(xì)菌則未檢測到(對照為約5％)；長期施無機(jī)化肥的菜田土壤，其Acidobacteria類細(xì)菌數(shù)量有所增加，比對照增加約8％，其余則與對照差異都在3％以下。 5.采用細(xì)菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增、DGGE、克隆、RFLP及測序等方法，以抗感青枯病番茄品種為材料，對

9、接種及不接種的番茄根表細(xì)菌，及不同感病程度的番茄根際細(xì)菌進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明，(1)發(fā)病番茄根表與未發(fā)病番茄根表具有不同的DGGE條帶；(2)發(fā)病程度不同的番茄，其根際細(xì)菌的DGGE條帶也各不相同，發(fā)病程度越近，DGGE譜帶的相似性也越高；(3)抗病品種根表細(xì)菌群落分布的均勻度、細(xì)菌群落多樣性及細(xì)菌基因型數(shù)都要高于感病品種，抗病品種與感病品種分別具有不同的優(yōu)勢基因型，抗感品種在細(xì)菌類群上也存在著差異，感病品種的γ-proteobac

10、teria類細(xì)菌要超過抗病品種，而對于β-proteobacteria和Sphigobacteria，抗病品種則都要超過感病品種。 6.采用從營養(yǎng)液中直接提取微生物總DNA，并用細(xì)菌16S rDNA特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、克隆和測序等一系列分子生物學(xué)手段，對不同磷鈣元素水平番茄營養(yǎng)液中細(xì)菌多樣性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，各種元素水平的番茄營養(yǎng)液，均有相似的條帶，只是亮度上有些差異。與對照相比，各處理元