利用分子學(xué)方法研究生鮮乳中細(xì)菌的多樣性.pdf

1、牛乳及乳制品具有極高的營養(yǎng)價(jià)值，在人們?nèi)粘５纳攀辰Y(jié)構(gòu)中占有重要的地位和作用。同時(shí)，它也為各類細(xì)菌的生長滋生提供了良好的介質(zhì)。生鮮乳的品質(zhì)好壞是影響乳制品質(zhì)量安全的關(guān)鍵，必須從根源上控制生鮮乳的質(zhì)量。因此，有必要建立一種快速有效的檢測(cè)方法對(duì)生鮮乳中微生物的種類及群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。
　　本研究選擇山東和寧夏的生鮮乳(即剛擠出的未經(jīng)處理的生鮮牛奶)作為研究對(duì)象，采用傳統(tǒng)分離純化、生理生化特性的分析、可培養(yǎng)菌株DNA的提取-PCR擴(kuò)增16

2、S rDNA基因片段-分子測(cè)序獲取生鮮乳中菌群的16S rRNA基因全序列信息，應(yīng)用微生物學(xué)方法和分子生物學(xué)方法相結(jié)合的方式對(duì)山東和寧夏生鮮乳中細(xì)菌的種類、菌群多樣性和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。對(duì)16S rDNA序列分析結(jié)果表明：山東A、B、C三處在6月份的生鮮乳奶樣中34株可培養(yǎng)菌株鑒定出來的細(xì)菌種屬主要有不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter sp.占細(xì)菌總數(shù)的26.5％和克雷伯氏菌屬Klebsiella sp.占細(xì)菌總數(shù)的14.7%。寧夏D

3、、E、F三處在10月份的生鮮乳奶樣中21株可培養(yǎng)菌株鑒定出來的細(xì)菌種屬主要有乳酸乳球菌乳酸亞種Lactococcus lactis subsp.lactis和不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter sp.分別占細(xì)菌總量的33.3%和14.3%。山東A處在10月份的生鮮乳樣中9株可培養(yǎng)菌鑒定出的細(xì)菌種類主要是綠膿假單胞菌Pseudomonas aeruginosa占細(xì)菌總數(shù)的22.2%。
　　由于大部分的細(xì)菌不能通過培養(yǎng)的方式被鑒定出

4、來的，因此通過純培養(yǎng)的方式不能真正反映生鮮乳中細(xì)菌的種類多樣性。由于生鮮乳中的菌量較少，直接提取宏基因組DNA較困難，因而本研究先將生鮮乳中的菌體快速過濾富集后，再提取宏基因組DNA，以細(xì)菌的通用引物27F和1492R擴(kuò)增16S rDNA片段，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與T-載體相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5α，菌落 PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并用限制性內(nèi)切酶MspI和HaeⅢ對(duì)陽性轉(zhuǎn)化子的菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物16S rDNA片段進(jìn)行酶

5、切，獲得酶切指紋圖譜，利用ARDRA多態(tài)性分析聚類，去除兩種酶切產(chǎn)物都相同的菌株，挑選出代表性菌株并進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，獲得生鮮乳中細(xì)菌的16S rDNA文庫，對(duì)16S rDNA序列分析結(jié)果表明：山東10月份生鮮乳樣A克隆文庫中主要乳酸菌Lactic acid bacterium占克隆總數(shù)的25%。寧夏克隆文庫主要為乳球菌屬Lactococcus sp.占克隆總數(shù)的62.5%。
　　由于利用16S rDNA-ARDRA建立克