蝦蟹混養(yǎng)池細(xì)菌多樣性的研究.pdf

1、本論文針對(duì)當(dāng)前海水養(yǎng)殖環(huán)境微生物作用研究的熱點(diǎn)問題，首次將PCR-DGGE技術(shù)引入到我國蝦蟹混養(yǎng)池微生物生態(tài)學(xué)的研究領(lǐng)域，優(yōu)化了蝦蟹混養(yǎng)池沉積物的總DNA提取方法及DGGE分離方法，并結(jié)合傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)方法對(duì)泉州灣灘涂蝦蟹混養(yǎng)池的沉積物及水體的理化因子、細(xì)菌數(shù)量及細(xì)菌多樣性隨養(yǎng)殖時(shí)間推移的動(dòng)態(tài)變化及空間上的變化進(jìn)行了研究，同時(shí)對(duì)沉積物細(xì)菌總DNA的DGGE圖譜的16Sr DNA片段的主要亮帶進(jìn)行克隆、測(cè)序。研究取得以下主要結(jié)果：

2、 1.沉積物總DNA提取的方法：先以TENP緩沖液去除沉積物中的腐殖酸，繼之以溶菌酶-SDS溫和裂解，其提取效率達(dá)90％以上，所獲DNA產(chǎn)量達(dá)2-20μg/g濕重沉積物，片段大小均在23 kb左右，不經(jīng)純化即可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增和限制性酶切等分子生物學(xué)操作。 2.DGGE分離方法：采用對(duì)大多細(xì)菌的16S rRNA基因V3區(qū)具有特異性的引物對(duì)GC-341F和517R，以普通Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將長(zhǎng)約200bp的擴(kuò)增產(chǎn)物使用變性

3、劑濃度梯度為40％到60％的8％的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離，最后對(duì)電泳譜圖進(jìn)行分析，得出其中細(xì)菌多樣性的信息。 3.檢測(cè)池在整個(gè)養(yǎng)殖期，理化因子都在對(duì)蝦養(yǎng)殖耐受范圍內(nèi)，呈波動(dòng)狀態(tài)，不存在明顯的規(guī)律；沉積物中的總菌數(shù)(DAPI計(jì)數(shù))隨著養(yǎng)殖時(shí)間的推移呈波動(dòng)狀態(tài)、總體呈上升趨勢(shì)，與總有機(jī)碳呈明顯的相關(guān)性；水體及沉積物中的異養(yǎng)菌數(shù)、弧菌總數(shù)都呈波動(dòng)狀態(tài)、總體呈下降趨勢(shì)，與水溫、溶解氧、總氮、磷酸鹽等環(huán)境因子相關(guān)性不明顯。 4.新

4、舊池水體及沉積環(huán)境都存在豐富的細(xì)菌多樣性，但相對(duì)而言，放苗前和養(yǎng)成前期均較低，從養(yǎng)成中期開始逐漸升高，養(yǎng)成末期又有所下降；其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在整個(gè)養(yǎng)殖期處于動(dòng)蕩變化狀態(tài)；沉積物細(xì)菌多樣性較水體的豐富且穩(wěn)定性較好；DGGE法研究蝦池的群落結(jié)構(gòu)變化與可培養(yǎng)異養(yǎng)菌數(shù)的變化之間沒有明顯的相關(guān)性。 5.對(duì)沉積物DGGE圖譜上的特征條帶進(jìn)行回收測(cè)序，測(cè)序結(jié)果為：γ-變形桿菌亞群、δ-變形菌亞群、擬桿菌群、厚壁菌群、放線菌群、綠彎菌群和一些未知菌