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文檔簡介
1、胰島素療效確切,上市己長達(dá)八十年,至今仍是各型糖尿病,尤其是中、重度糖尿病患者維持正常血糖水平和治療糖尿病相關(guān)酮癥、酸血癥及糖尿病性昏迷不可或缺的藥物,臨床地位十分重要。但是,傳統(tǒng)的短中效胰島素具有作用時間不夠長,需要每天多次注射,病人依從性差;皮下注射有吸收峰值;睡前注射有增加夜間低血糖危險等缺點。甘精胰島素作為一種長效胰島素,具有每天注射1次即能維持24小時;吸收穩(wěn)定,吸收后無峰值,減少低血糖發(fā)生;具有良好的生物利用度,血糖控制穩(wěn)定
2、的優(yōu)點。長效是未來胰島素的發(fā)展方向。
研究目的:構(gòu)建含有短C肽EAEDKR的甘精胰島素原PET32a-glargine的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),篩選高效分泌表達(dá)的origami(DE3)plysS及origami(DE3)重組工程菌,獲得glargine(甘精胰島素)重組蛋白。建立PET32a-glargine/origami(DE3)plysS及PET32a-glargine/origami(DE3)由上游構(gòu)建至破菌、純化、酶切的
3、生產(chǎn)工藝,得到具有正確活性結(jié)構(gòu)的純度較高的glargine。
研究方法:
?、貾ET32a-glargine的上游構(gòu)建:1)全基因合成含有短C肽EAEDKR的甘精胰島素原基因序列。2)利用PET32a質(zhì)粒上的BamH I及Hind III酶切位點,將glargine插入到PET32a中,構(gòu)建PET32a-glargine重組質(zhì)粒。3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Jm109工程菌中,篩選高拷貝質(zhì)粒。4)將高拷貝質(zhì)粒轉(zhuǎn)入origami(
4、DE3)plysS及origami(DE3)重組工程菌中。5)利用不同篩選壓力,誘導(dǎo)劑,誘導(dǎo)方法來獲得高表達(dá)origami(DE3) plysS及origami(DE3)菌株。6)優(yōu)化條件,發(fā)酵罐發(fā)酵。
?、赑ET32a-glargine/origami(DE3)plysS及PET32a-glargine/origami(DE3)破菌工藝的研究:測試在不同PH及各種破菌液條件下的破菌情況,選擇破菌完全且大多以可溶方式存在的破菌條
5、件。
?、跿rx-glargine的純化與酶切:發(fā)酵液經(jīng)Ni柱及Q柱純化后,以胰酶酶切,HPLC監(jiān)測酶切效果。并以反相C-18柱回收,質(zhì)譜鑒定確定結(jié)構(gòu)。
研究結(jié)果:
?、賁DS-PAGE、HPLC和質(zhì)譜分析出glargine的分子量與理論分子量相符。
?、赑ET32a-glargine/origami(DE3)表達(dá)量高,可達(dá)1g/L.
③回收率低,僅為40%,但明顯高于以往報道。
結(jié)
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