狂犬病的探索治療以及相關(guān)病毒在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用.pdf

1、狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus，RABV)感染動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)致神經(jīng)活動(dòng)紊亂的一種人畜共患病，致死率高達(dá)100％?？袢≡谌蚍秶鷥?nèi)分布廣泛，當(dāng)前對(duì)狂犬病的防控仍不徹底，每年依然有上萬(wàn)例狂犬病患者死亡。目前針對(duì)狂犬病防控和治療的研究主要集中在RABV的疫苗研發(fā)、田間防疫、發(fā)病機(jī)理以及藥物控制等方面，但對(duì)狂犬病的治療仍然沒(méi)有有效的藥物和方法。由于狂犬病病毒侵染神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的功能紊亂，短時(shí)間內(nèi)嚴(yán)重威脅患者的生命，為了緩

2、解狂犬病毒引起的神經(jīng)紊亂并為機(jī)體免疫系統(tǒng)贏得抵抗狂犬病病毒的寶貴時(shí)間，我們利用目前對(duì)神經(jīng)具有保護(hù)作用的藥物-美金胺(memantine)來(lái)開(kāi)展該藥物在緩解狂犬病癥狀方面的研究，以期為狂犬病的臨床治療提供新的思路和方法。
　　另一方面，由于RABV對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的高度嗜性，是目前最為常用的高效逆行環(huán)路示蹤病毒之一。基于RABV開(kāi)發(fā)更為有效的環(huán)路示蹤工具將有助于神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)與功能的研究。因此，我們?cè)谝延械腞ABV反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上對(duì)病

3、毒基因組做出改造和修飾，拯救出了有標(biāo)記和操控功能的且傳播缺陷的糖蛋白缺失重組病毒(rRABV△G)，并且用于解析視覺(jué)神經(jīng)環(huán)路的精細(xì)結(jié)構(gòu)和功能。
　　具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.Memantine緩解狂犬病癥狀的研究
　　藥物memantine能夠通過(guò)血腦屏障，對(duì)神經(jīng)元表面N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA受體)非競(jìng)爭(zhēng)性可逆結(jié)合，對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用，

4、用于治療阿爾茨海默癥。為了探索該藥物能否緩解狂犬病毒造成的神經(jīng)活動(dòng)紊亂，我們開(kāi)展了如下實(shí)驗(yàn):(1)將RABV中強(qiáng)毒株CVS-24感染體外培養(yǎng)的原代神經(jīng)元，加入memantine后發(fā)現(xiàn)其對(duì)RABV引起的神經(jīng)元損傷有一定的保護(hù)作用;(2)在小鼠的RABV攻毒實(shí)驗(yàn)中，memantine對(duì)發(fā)病小鼠的治療作用有限，能微弱地延長(zhǎng)發(fā)病小鼠生存時(shí)間。作為對(duì)比，在日本乙型腦炎病毒(JapaneseEncephalitis Virus，JEV)感染的小鼠實(shí)

5、驗(yàn)中，memantine能顯著延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間、降低腦內(nèi)血管袖套和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，對(duì)小鼠腦內(nèi)病毒量也有降低作用。
　　2.利用狂犬示蹤病毒(rRABVAG)解析初級(jí)視覺(jué)皮層至丘腦環(huán)路的精細(xì)結(jié)構(gòu)
　　通過(guò)反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)改造rRABV-SAD，敲除糖蛋白(glycoprotein，G)基因并插入多種顏色的熒光蛋白基因，得到多色狂犬示蹤病毒。將該病毒注射到小鼠丘腦背外側(cè)核（lateraldorsal of thalamus nu

6、cleus，LD）、丘腦后外側(cè)核(lateralposteriorof thalamus nudleus，LP)和外側(cè)膝狀體背側(cè)核(dorsal part of lateral geniculate nucleus，dLGN)等初級(jí)視覺(jué)皮層(primary cisual cortex，V1)的投射靶區(qū)，逆行標(biāo)記靶向該區(qū)的V1皮層神經(jīng)元，通過(guò)熒光顏色將靶向丘腦特定核團(tuán)的V1神經(jīng)元分群，并分析了它們的分布特點(diǎn);同時(shí)我們觀察到一些同時(shí)投射到丘

7、腦的多個(gè)核團(tuán)的V1皮層神經(jīng)元即多靶神經(jīng)元，進(jìn)一步結(jié)合熒光顯微光學(xué)切片斷層成像技術(shù)(fluorescencemicro-optical sectioning tomography，fMOST)，我們對(duì)單細(xì)胞水平的V1皮層多靶神經(jīng)元進(jìn)行了全腦精細(xì)成像;為了進(jìn)一步追蹤靶向丘腦特點(diǎn)核團(tuán)的V1神經(jīng)元的上游環(huán)路，我們?cè)赩1皮層感染AAV病毒補(bǔ)充狂犬病毒的G蛋白，使V1神經(jīng)元內(nèi)的rRABV△G逆行跨單級(jí)突觸標(biāo)記上游神經(jīng)元，從而解析了V1-LD、V1-

8、LP和V1-dLGN環(huán)路的上游環(huán)路，進(jìn)而對(duì)上游神經(jīng)元的分布和數(shù)量進(jìn)行全腦范圍內(nèi)統(tǒng)計(jì)分析，最終得到全面而詳細(xì)的V1至丘腦環(huán)路的精細(xì)結(jié)構(gòu)。
　　3.利用改造的嗜神經(jīng)病毒初步探索V1至丘腦環(huán)路的功能
　　結(jié)合rRABV△G病毒示蹤技術(shù)和在體雙光子鈣成像技術(shù)，我們對(duì)V1-丘腦核團(tuán)的環(huán)路進(jìn)行功能上的探索，主要在樹(shù)突棘和樹(shù)突水平分析了靶向丘腦不同核團(tuán)的V1神經(jīng)元的自發(fā)神經(jīng)活動(dòng)特點(diǎn)，從而對(duì)比V1-丘腦特定核團(tuán)投射環(huán)路中V1神經(jīng)元接收上游環(huán)

9、路的輸入的差異。
　　4.單眼視覺(jué)剝奪的病理模型中V1至丘腦環(huán)路的結(jié)構(gòu)可塑性
　　在單眼視覺(jué)剝奪(monocular deprivation，MD)模型下，結(jié)合rRABV△G病毒示蹤、光遺傳學(xué)和在體光纖記錄手段探索V1-丘腦環(huán)路的可塑性。通過(guò)rRABV△G-eGFP病毒對(duì)MD小鼠對(duì)側(cè)丘腦核團(tuán)逆行標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)逆標(biāo)的V1神經(jīng)元數(shù)量與對(duì)照相比顯著減少，提示在視覺(jué)形成關(guān)鍵期對(duì)小鼠單眼視覺(jué)剝奪能夠引起V1-丘腦投射的減少;進(jìn)一步通過(guò)光遺