Viperin抑制狂犬病病毒機理的探索研究.pdf

1、Viperin是一種干擾素誘導蛋白，可通過完全不同的機制對多種病毒發(fā)揮抗病毒活性。先前的研究沒有viperin抑制狂犬病病毒(RABV)復制的報道。通?？袢〔《驹谄湟赘屑毎猩L良好，具有較高的病毒滴度。最近我們的研究中發(fā)現，狂犬病病毒在巨噬細胞RAW264.7中生長緩慢，病毒滴度顯著地低于易感細胞（如NA細胞）。進一步的研究發(fā)現，狂犬病病毒感染易感的NA細胞時，viperin表達微弱或不表達，但感染巨噬細胞時viperin被顯著誘導

2、表達。
　　本研究為了探索抗病毒蛋白viperin的表達是否抑制狂犬病病毒的復制，我們構建了viperin的真核表達載體，通過瞬時轉染BSR-T7細胞，過表達viperin，證實了過表達viperin能抑制狂犬病病毒rRC-HL的復制，在一定范圍內狂犬病病毒N、P和M蛋白在細胞中的表達量明顯被抑制，狂犬病病毒滴度顯著降低。通過篩選穩(wěn)定表達viperin的BHK-21細胞系，感染狂犬病病毒，發(fā)現穩(wěn)定表達viperin的BHK-21細

3、胞系對狂犬病病毒rRC-HL株的抑制效果更加明顯，顯著抑制了病毒蛋白的合成。同樣穩(wěn)定表達viperin的BHK-21細胞系顯著抑制廣西分離強毒Ⅰ群和Ⅲ群代表株GX01和GXN119。
　　在此基礎上，為了進一步探索viperin抑制狂犬病病毒主要功能區(qū)域，本實驗構建了缺失viperin N末端兩親性的a螺旋區(qū)域及突變S-腺苷甲硫胺酸酶基序的突變體，測定這些突變體抑制狂犬病病毒的效果，結果顯示viperin的抑制狂犬病病毒復制活性區(qū)

4、域主要位于其N末端，其突變后抗狂犬病病毒能力顯著下降。S-腺苷甲硫胺酸酶基序的3個關鍵氨基酸(C83A/C87A/C90A)突變后，其抑制狂犬病病毒的能力也明顯下降。
　　先前的研究發(fā)現viperin的N末端可結合細胞的內質網及脂滴，擾亂細胞膜的脂筏結構來抑制病毒的出芽與釋放。為了探索viperin抑制狂犬病病毒復制的機理，本實驗就viperin對脂筏的重要組成成分膽固醇和鞘磷脂的生物學作用進行探索。首先在BSR-T7細胞中過表達

5、viperin，檢測細胞中膽固醇和鞘磷脂變化情況。結果顯示，過表達viperin能夠降低細胞中膽固醇和鞘磷脂的含量，推測viperin可能通過破壞膽固醇和鞘磷脂以抑制狂犬病病毒釋放。同時添加分別抑制膽固醇和鞘磷脂的藥物Mβ CD和Myroicin，發(fā)現破壞細胞的膽固醇和鞘磷脂對狂犬病病毒的吸附與穿入無影響，但對狂犬病病毒的出芽與釋放有抑制作用，證實了破壞細胞的膽固醇和鞘磷脂是viperin抑制狂犬病病毒復制的重要途徑之一。
　　V

6、iperin是干擾素誘導蛋白，受干擾素的誘導和調控，本實驗進一步探索狂犬病病毒感染巨噬細胞上調viperin基因的上游信號傳導通路，應用芯片技術對狂犬病病毒感染RAW264.7細胞后，84個免疫應答基因及幾個主要看家基因轉錄譜進行了分析。結果顯示，狂犬病病毒感染巨噬細胞后12、24和36 h三個時間點都上調2倍以上的基因共有26個;12h上調2倍以上、24和36 h無明顯變化的基因有2個;12和24 h上調2倍以上、36 h無明顯變化的

7、基因有1個;12h無變化、24和36 h上調2倍以上的基因有15個;12和24 h無變化、36 h上調2倍以上的基因有17個;12、24和36 h三個時間點都沒有明顯變化（小于2倍）的基因有25個;12、24和36 h三個時間點都下調2倍以上的基因有1個。其中，Cxcl10基因在12、24和36 h三個時間點上調倍數分別為377.85、333.14和183.12倍;IFNβ基因分別為370.07、68.12和13.09倍?？袢〔《靖腥?/p>

8、RAW264.7細胞也會引起TLRs不同程度升高，TLR3基因分別為156.68、380.03和164.66倍，TLR2和TLR8基因呈一定程度的上調表達，TLR1、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7和TLR9也有較顯著的變化。
　　上述實驗證明TLRs參與了狂犬病病毒感染RAW264.7細胞的免疫信號傳導。根據TLR4能夠識別病毒的囊膜蛋白傳遞免疫信號和激活機體固有免疫、TLR3識別雙鏈RNA(dsRNA)和病毒復制過程中產

9、生的中間復合物的特性，本研究使用流式細胞術證明了巨噬細胞感染狂犬病病毒后，顯著上調TLR4的表達，說明狂犬病病毒激活了TLR4;然而再用滅活的狂犬病病毒孵育巨噬細胞，發(fā)現保留了基本自然特性的狂犬病病毒囊膜糖蛋白能夠誘導viperin的表達。進一步用TLR4的特異性抑制劑(TAK-242)阻斷TLR4信號的傳導，顯示viperin的表達量顯著減少，說明TLR4參與了識別狂犬病病毒并誘導viperin表達。為了驗證TLR3與狂犬病病毒相互作

10、用及其誘導viperin表達的固有免疫反應，本實驗首先構建了TLR3基因敲除的TLR3-/-RAW264.7細胞系，感染狂犬病病毒，檢測viperin蛋白的變化情況，顯示敲除了TLR3基因的TLR3-/-RAW264.7細胞可顯著推遲并減少viperin蛋白表達量，說明TLR3參與識別狂犬病病毒核酸并誘導viperin的表達。
　　NF-κB和IRF3是固有免疫信號通路中兩個重要的免疫因子，用NF-κB的特異性抑制劑抑制其通路的信

11、號傳導，然后感染狂犬病病毒，結果顯示抑制NF-κB通路的信號傳導，viperin的表達量幾乎不受影響，說明狂犬病病毒上調viperin與NF-κB信號通路沒有直接關聯性。用IRF3的特異性抑制劑格爾德霉素抑制處理細胞后，可抑制IRF3的分子伴侶Hsp90，使viperin的表達時間推遲并減少表達量，說明IRF3參與了狂犬病病毒誘導viperin表達的調控。
　　綜上所述，狂犬病病毒感染巨噬細胞RAW264.7可誘導干擾素誘導蛋白v

12、iperin表達，viperin表達具有抑制狂犬病強毒、弱毒復制的作用。這種抑制作用主要通過破壞RAW264.7細胞膜的膽固醇和鞘磷脂，阻礙病毒的出芽和釋放。進一步的芯片技術研究發(fā)現，巨噬細胞RAW264.7感染狂犬病病毒時多數TLRs的表達受到影響。當用狂犬病病毒感染敲除TLR3基因的TLR3-/-RAW264.7細胞，viperin的表達量比正常RAW264.7細胞顯著減少并延后;用TLR4抑制劑TAK-242可抑制狂犬病病毒誘導v