5’-肌苷酸生產(chǎn)菌構(gòu)建及發(fā)酵工藝研究.pdf

1、5'-肌苷酸作為新一代增味劑的重要組成成份，在調(diào)味品行業(yè)占據(jù)了十分重要的地位，此外，在奶粉、飼料和保健品行業(yè)中，其作為功能型添加劑的應(yīng)用也十分廣泛。20世紀初，日本科學(xué)家開始了發(fā)酵生產(chǎn)5'-肌苷酸的研究，但目前為止，5'-肌苷酸發(fā)酵生產(chǎn)仍存在發(fā)酵周期過長，工藝控制過程十分復(fù)雜等缺點。本文以酸性磷酸酶(Acid phosphotranferase，AP/PTase)為研究對象，通過構(gòu)建大腸桿菌及枯草芽孢桿菌重組菌，對5'-肌苷酸二步發(fā)酵工

2、藝進行研究;并以構(gòu)建的大腸桿菌重組菌為出發(fā)菌，對其發(fā)酵工藝，催化工藝進行了初步探究，為5'-肌苷酸新生產(chǎn)方法的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　本文研究了以基因序列phoCY及突變序列phoCYM分別編碼的AP/PTase及AP/PTaseM催化生產(chǎn)5'-肌苷酸的最適條件，并驗證了二者催化能力，發(fā)現(xiàn)二者最適pH分別為pH4.5和pH5.2，最適溫度均為35℃。AP/PTaseM催化能力為AP/PTase的3.05倍。在此條件下，探究了多種金屬

3、離子及表面活性劑對AP/PTaseM的影響，結(jié)果表明在5～10 mmol/L范圍內(nèi)，Mg2+、Mn2+、Fe2+、Zn2+對AP/PTaseM酶活有促進作用，但在高濃度環(huán)境中，酶活受到強烈抑制;此外，表面活性劑對酶促反應(yīng)有明顯促進作用，當(dāng)添加8.0％ Tween60或5.0％ Triton X-100時，轉(zhuǎn)化率分別提高49.98％和40.57％。
　　接著，以大腸桿菌重組菌XL1-Blue+pQE30-phoCYM為出發(fā)菌株，利用

4、5L發(fā)酵罐確定了一種獲得高酶活的細胞發(fā)酵工藝。誘導(dǎo)劑最適添加時機為對數(shù)前期(OD600=2.0～2.5)，32℃持續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)8h，酶活達到最高，為1980.07 U/L。在此條件下，催化8h底物最適濃度分別為肌苷120mmol/L，十水合焦磷酸鈉200 mmol/L，轉(zhuǎn)化率達99.32％.
　　由于目前肌苷發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)已十分成熟，本文進一步提出了二步法生產(chǎn)5'-肌苷酸，即與肌苷發(fā)酵相偶聯(lián)，在肌苷發(fā)酵液中催化生產(chǎn)5'-肌苷酸，設(shè)計出

5、兩種方案:1、以肌苷生產(chǎn)菌B.subtilis JG為出發(fā)菌株，利用穿梭質(zhì)粒pBE43和pBSA43，構(gòu)建了兩株能夠表達AP/PTaseM的重組菌B.subtilis JAB及B.subtilis JAF，進行二步法搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)和催化反應(yīng)，二者5'-肌苷酸產(chǎn)量分別為2.35 g/L、2.96 g/L。2、以XL1-Blue+pQE30-phoCYM全細胞催化B.subtilis JG肌苷發(fā)酵液。初步探究了發(fā)酵液處理方式及EDTA添加量，