miR-26a和miR-30c協(xié)同調(diào)控TGFβ1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化在糖尿病腎臟病中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病患者常見的慢性微血管并發(fā)癥，其發(fā)病率隨著糖尿病的快速增長(zhǎng)而逐年上升，已成為終末期腎病的主要原因，DKD的防治也成為內(nèi)分泌科和腎臟科醫(yī)師面臨的難題之一。然而該病的發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全闡明，既往認(rèn)為DKD的早期病變部位主要在腎小球，近年來的研究發(fā)現(xiàn)腎小管病變無論從發(fā)病時(shí)間或發(fā)病機(jī)制看均有其獨(dú)立性，并且腎小管病變及腎間質(zhì)纖維化的程度與腎功能的相關(guān)性

2、比腎小球硬化與腎功能的相關(guān)性更為密切，故腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生機(jī)制越來越受到人們重視。
　　近年來的研究表明，miR-26和miR-30家族在多器官組織的纖維化、凋亡等病理生理進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用。在特發(fā)性肺纖維化細(xì)胞模型中，miR-26a通過抑制靶基因Lin28B進(jìn)而調(diào)控let-7d的表達(dá)，從而抑制肺纖維化。NF-κB調(diào)控miR-26a的表達(dá)，而miR-26a進(jìn)一步靶向調(diào)控Col-I和CTGF，從而緩解心肌纖維化。在豬腎血管疾病

3、模型中，通過原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)miR-26a主要表達(dá)在腎小管細(xì)胞中，且在腎血管疾病模型中表達(dá)顯著降低，同時(shí)抑制miR-26a則可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)促凋亡蛋白表達(dá)。miR-133和miR-30c均通過抑制靶基因CTGF從而緩解了心肌纖維化。miR-30通過靶作用于Notch1和p53從而抑制足細(xì)胞損傷。但是在糖尿病腎臟病腎纖維化，尤其是在腎小管上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程中，miR-26a和miR-30c的研究較少，因此本研究旨在探索miR

4、-26a和miR-30c在糖尿病腎臟病腎小管上皮細(xì)胞EMT中的作用以及具體機(jī)制。
　　最近研究表明miRNA不但可以調(diào)控多個(gè)基因，多個(gè)miRNA也可以同時(shí)調(diào)控一個(gè)基因的表達(dá)，形成一張復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而更加精確地對(duì)機(jī)體進(jìn)行調(diào)控。然而，目前在miRNA領(lǐng)域，大多數(shù)研究探索單一miRNA對(duì)單一靶點(diǎn)的影響，近年來，多個(gè)miRNA協(xié)同靶作用于一個(gè)基因和單一miRNA同時(shí)調(diào)控多個(gè)靶點(diǎn)正在成為熱點(diǎn)，比如在乳腺癌中，miR-143和miR-14

5、5協(xié)同調(diào)控靶基因ERBB3從而抑制細(xì)胞增殖和侵襲。此外，miR-455同時(shí)靶作用于Necdin、Runx1t1和HIF1an三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)控棕色脂肪細(xì)胞的分化。目前在DKD領(lǐng)域，探索多個(gè)miRNA協(xié)同參與糖尿病腎臟病的研究較少。本研究致力于探索miR-26a和miR-30c是否能分別調(diào)控糖尿病腎臟病的進(jìn)展，同時(shí)探索 miR-26a和miR-30c是否具有協(xié)同作用。首先，我們使用TGFβ1(10ng/ml)刺激腎小管上皮細(xì)胞(NRK

6、-52E)，比較miR-26a與miR-30c以及纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)我們檢測(cè)了40周齡OLETF大鼠皮質(zhì)中miR-26a與miR-30c的表達(dá)，進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證miR-26a、miR-30c與DKD的關(guān)系;通過生物信息學(xué)方法，我們預(yù)測(cè)miR-26a和miR-30c均靶作用于CTGF，同時(shí)預(yù)測(cè)Snail1為miR-30c的靶基因，并且進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明假設(shè);接下來我們?cè)贜RK-52E細(xì)胞中分別和同時(shí)過表達(dá)或敲除miR-2

7、6a與miR-30c，探索miR-26a與miR-30c是否協(xié)同作用于腎小管上皮細(xì)胞EMT。機(jī)制部分，我們進(jìn)一步探索miR-26a與miR-30c是否同時(shí)調(diào)控ERK1/2和p38 MAPK信號(hào)通路，并同時(shí)敲除miR-26a與miR-30c的靶基因CTGF和Snail1，觀察是否這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子存在協(xié)同調(diào)控EMT的作用。
　　方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　將凍存的大鼠腎小管上皮細(xì)胞株（NRK-52E）置于37℃中水浴鍋中復(fù)

8、蘇，培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基中（含10％FBS），并在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育。每2-3天更換新的培養(yǎng)基。
　　2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　(1)miRNA的mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染
　　轉(zhuǎn)染前一天，細(xì)胞接種于12孔板中，每孔鋪約3*104個(gè)細(xì)胞。第二天采用lipo3000進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染（操作按lipo3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行）。miRNA的mimic轉(zhuǎn)染濃度為50nM，miRNA的inhibitor轉(zhuǎn)染濃度為1

9、50nM，共轉(zhuǎn)染2種miRNA的mimic/inhibitor時(shí)，則每種mimic/inhibitor用量減半，保證每組miRNA的mimic/inhibitor用量相等。
　　(2)siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
　　轉(zhuǎn)染前一天，細(xì)胞接種于12孔板中，轉(zhuǎn)染時(shí)每孔鋪約3*104個(gè)細(xì)胞。第二天采用lipo3000進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染（操作按lipo3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行）。 siRNA轉(zhuǎn)染濃度為50nM。共轉(zhuǎn)染2種siRNA時(shí)，則每種siRN

10、A用量減半，保證每組siRNA用量相等。
　　(3)質(zhì)粒和mimic共轉(zhuǎn)
　　轉(zhuǎn)染前一天，細(xì)胞按種于24孔板中，轉(zhuǎn)染時(shí)每孔鋪約1.5*104。第二天采用lipo3000進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染（操作按lipo3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行）。24孔板中mimic的轉(zhuǎn)染量為50nM，熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量為1μg，內(nèi)參β-gal質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量均為0.2μg。共轉(zhuǎn)染2種miRNA的mimic時(shí)，則每種mimic用量減半，保證每組miRNA的mi

11、mic用量相等。
　　結(jié)果:
　　1.miR-26a和miR-30c在TGFβ1誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞和OLETF大鼠腎皮質(zhì)中的變化
　　10ng/mL TGFβ1刺激NRK-52E細(xì)胞72h，Western Blot和qRT-PCR檢測(cè)均發(fā)現(xiàn):與Control組相比，TGFβ1組中FN、Col-Ⅰ、α-SMA、CTGF和Snail1表達(dá)均顯著升高，E-cadherin表達(dá)顯著下降。同時(shí)，qRT-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn):與

12、Control組相比，TGFβ1組中miR-26a和miR-30c表達(dá)均顯著下降。這表明miR-26a和miR-30c均可能參與到DKD的進(jìn)程。
　　2.miR-26a和miR-30c通過靶基因CTGF和Snail1協(xié)同調(diào)控TGFβ1誘導(dǎo)的EMT
　　1)靶基因鑒定
　　a)Targetscan生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)CTGF基因3'UTR區(qū)中含有miR-26a和miR-30c的結(jié)合位點(diǎn)，而Snail1基因3'UTR區(qū)中也含

13、有miR-30c的結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了miR-26a和miR-30c均靶作用于CTGF且具有協(xié)同作用，而miR-30c靶作用于Snail1。
　　b)Western blot和qRT-PCR檢測(cè)均證明轉(zhuǎn)染miR-26a或miR-30c的mimic下調(diào)CTGF的表達(dá)，共轉(zhuǎn)染miR-26a和miR-30c的mimic具有協(xié)同下調(diào)CTGF的作用;而轉(zhuǎn)染miR-30c的mimic下調(diào)Snail1的表達(dá)。
　　2)mi

14、R-26a和miR-30c協(xié)同調(diào)控NRK-52E細(xì)胞EMT
　　a)Western Blot和qRT-PCR檢測(cè)均證明:在存在TGFβ1的情況下，轉(zhuǎn)染miR-26a或miR-30c的mimic均下調(diào)FN、Col-I和α-SMA，上調(diào)E-cadherin;共轉(zhuǎn)染miR-26a和miR-30c的mimic則協(xié)同下調(diào)FN、Col-Ⅰ和α-SMA，并且協(xié)同上調(diào)E-cadherin。
　　b)在存在TGFβ1的情況下，轉(zhuǎn)染miR-26

15、a或miR-30c的inhibitor上調(diào)FN、Col-Ⅰ、α-SMA，同時(shí)下調(diào)E-cadherin。共轉(zhuǎn)染miR-26a和miR-30c的inhibitor協(xié)同上調(diào)FN、Col-Ⅰ、α-SMA，同時(shí)協(xié)同下調(diào)E-cadherin。
　　結(jié)論:
　　1、miR-26a和miR-30c在TGFβ1誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞以及在40周齡的OLETF大鼠腎臟皮質(zhì)中表達(dá)明顯下調(diào);
　　2、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-26a和

16、miR-30c協(xié)同靶作用于與CTGF，miR-30c靶作用于Snail1;過表達(dá)miR-26a或miR-30c分別下調(diào)CTGF表達(dá)，同時(shí)過表達(dá)miR-26a和miR-30c則協(xié)同下調(diào)CTGF表達(dá)。過表達(dá)miR-30c下調(diào)Snail1表達(dá);
　　3、與單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-26a和miR-30c的mimic(inhibitor)相比，共轉(zhuǎn)染miR-26a和miR-30c的mimic(inhibitor)協(xié)同抑制（增強(qiáng)）TGFβ1誘導(dǎo)的EM