黃芪甲苷對TGF--β1誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究黃芪甲苷(AstragalosideⅣ)對轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)的作用，并探討其機(jī)制是否為通過調(diào)控間隙連接蛋白43(Connexin43，Cx43)的表達(dá)，調(diào)節(jié)磷酸肌醇-3激酶-蛋白激酶-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白受體(PI3K/AKT/mTOR)通路活性。
　　方法：1.TGF-β1最佳刺激濃度及時間篩選：體外培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E，予

2、以不同濃度TGF-β1(0-10ng/ml)分別刺激細(xì)胞24h和48h，免疫印跡法檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)分化標(biāo)志蛋白，纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N），α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-sma)的表達(dá)水平，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，選擇最適作用時間和最佳刺激濃度。2.黃芪甲苷無毒劑量篩選：不同濃度梯度黃芪甲苷(0-200μg/ml)作用細(xì)胞48h，通過CCK-8(Cell Counting Kit-8)法

3、檢測各組細(xì)胞活性，選出黃芪甲苷對細(xì)胞活性無影響的濃度范圍，然后在此濃度范圍內(nèi)選出低、中、高三個濃度作為藥物干預(yù)濃度。3.黃芪甲苷干預(yù)效果評估：根據(jù)以上結(jié)果將細(xì)胞分為正常對照組，TGF-β1刺激組，低、中、高濃度黃芪甲苷干預(yù)組。收集各組細(xì)胞樣品，定量PCR(quantitative PCR，qPCR)及免疫熒光檢測各組細(xì)胞鈣粘附蛋白E(E-cadherin)、α-sma、Cx43mRNA和蛋白的表達(dá)水平。免疫印跡法檢測NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)

4、分化相關(guān)蛋白、Cx43蛋白、PI3K/AKT/mTOR通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平。最后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，分析細(xì)胞增殖情況。
　　結(jié)果：1.不同濃度TGF-β1刺激NRK-52E細(xì)胞24h，TGF-β1濃度為6ng/ml以上時，F(xiàn)N的表達(dá)增加(P＜0.01)，TGF-β1濃度為2ng/ml以上時，α-sma的表達(dá)增加(P＜0.01)。再用同樣濃度梯度TGF-β1刺激NRK-52E細(xì)胞48h，TGF-β1濃度為6ng/ml以上時

5、，F(xiàn)N和α-sma表達(dá)增加(P＜0.01)。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇TGF-β1誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的最適作用時間為48h，最佳刺激濃度為6ng/ml。2.CCK-8法檢測不同濃度梯度黃芪甲苷（0-200μg/ml）作用細(xì)胞48h細(xì)胞活力的改變，黃芪甲苷濃度為0-120μg/ml時，細(xì)胞活力與正常對照組比較無差異(P＞0.05)，黃芪甲苷濃度為160μg/ml及以上時，細(xì)胞活力降低(P＜0.05)。3.qPCR檢測E-cadheri

6、n、α-sma、Cx43mRNA表達(dá)水平，TGF-β1刺激組與正常對照組比較，E-cadherin、Cx43mRNA表達(dá)均降低，黃芪甲苷干預(yù)后，E-cadherin mRNA表達(dá)呈濃度依賴性升高(P＜0.01)，中、高濃度藥物干預(yù)后Cx43mRNA表達(dá)升高（P＜0.01），TGF-β1刺激組與正常對照組比較，α-sma mRNA表達(dá)升高，黃芪甲苷干預(yù)后其表達(dá)呈濃度依賴性降低(P＜0.01)。4.免疫熒光檢測各組細(xì)胞E-cadherin、

7、α-sma、Cx43蛋白表達(dá)情況，TGF-β1刺激后，α-sma蛋白熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，不同濃度黃芪甲苷干預(yù)后熒光強(qiáng)度減弱，TGF-β1刺激后，E-cadherin、Cx43蛋白熒光強(qiáng)度均減弱，黃芪甲苷干預(yù)后，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。5.免疫印跡法檢測各蛋白表達(dá)水平，TGF-β1刺激后，α-sma和波形蛋白(vimentin)蛋白表達(dá)量升高，中、高濃度黃芪甲苷干預(yù)后，α-sma表達(dá)量降低(P＜0.05)，vimentin表達(dá)量降低(P＜0.01)，與正

8、常對照組比較，TGF-β1刺激后，E-cadherin和Cx43蛋白表達(dá)降低，黃芪甲苷干預(yù)后E-cadherin表達(dá)量呈濃度依賴性升高(P＜0.05)，Cx43表達(dá)量呈濃度依賴性升高(P＜0.05)。6.免疫印跡法檢測AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表達(dá)水平，計算p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值，TGF-β1刺激組p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR均升高，中、高濃度黃芪甲苷干預(yù)后，p-AKT/AKT降低(

9、P＜0.01)，低、中、高濃度黃芪甲苷干預(yù)后，p-mTOR/mTOR呈濃度依賴性降低(P＜0.01)。7.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，與正常組比較，TGF-β1刺激組G1期細(xì)胞比例降低，高濃度黃芪甲苷干預(yù)后G1期細(xì)胞比例增加(P＜0.01)。
　　結(jié)論：1.6ng/ml TGF-β1刺激NRK-52E細(xì)胞48h，能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化;2.黃芪甲苷能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化;3.黃芪甲苷可抑制TGF-β1導(dǎo)致的PI