內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白ATF6--CHOP在肝臟缺血再灌注操作中對細(xì)胞焦亡的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白在大鼠肝臟熱缺血再灌注損傷中的表達(dá)情況
　　目的：研究大鼠肝臟熱缺血再灌注損傷過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
　　方法：(1)大鼠肝臟熱缺血再灌注損傷模型及分組：選取36只SD雄性健康大鼠，體重約280-300g，用血管阻斷夾阻斷第一肝門，建立大鼠肝臟全肝阻斷缺血再灌注模型。分為對照組(Sham組)，缺血30分鐘再灌注0小時組

2、（IR0h組），再灌注1小時組(IR1h組)，再灌注6小時組（IR6h組），再灌注12小時組（IR12h組），再灌注24小時組（IR24h組），每組6只大鼠，分別于各時間點(diǎn)采集血液和肝臟組織標(biāo)本。(2)各組肝臟組織行HE染色，在光鏡下觀察組織病理變化，評估炎癥及組織壞死情況。(3)血液標(biāo)本送西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，采用全自動生化分析儀檢測大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspar

3、tate transaminase，AST)及(lactic dehydrogenase，LDH)的變化水平;采集的血液采用免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry，IHC)和免疫印跡(Western blot)法檢測各組焦亡相關(guān)蛋白caspase-1、caspase-11的表達(dá)情況;免疫印跡技術(shù)(Western blot，WB)檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、ATF6、CHOP的表達(dá)情況。以上方法收集到的數(shù)據(jù)均采用

4、均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）的形式來對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述，用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05時，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：(1)熱缺血再灌注損傷模型建立情況：成功建立大鼠肝臟熱缺血再灌注模型，熱缺血再灌注損傷各組病理學(xué)變化：HE染色于光鏡下見對照組肝臟細(xì)胞形態(tài)正常，核藍(lán)染，細(xì)胞質(zhì)均勻，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝竇呈條索狀排列緊密，中央靜脈結(jié)構(gòu)正常，其余各IR組均出現(xiàn)了不同程度的肝竇淤血、炎癥浸潤及組織壞死，I

5、R6h組及IR24h組肝臟組織均出現(xiàn)了大片狀壞死，其中IR24h組肝臟組織炎癥損傷最重，Suzuki評分顯示：Sham組為（0.67±0.51）分，IR0h組、IR1h組、IR6h組、IR12組、IR24h組分別為：（2.5±0.83）、（3±0.89）、(4.17±0.75)、(6.17±0.75)、（7.7±1.03）。(2)肝功能結(jié)果：隨著缺血再灌注時間的延長，大鼠ALT、AST及LDH呈逐漸升高的趨勢，IR6h時達(dá)到其峰值，之后

6、又隨著時間的延伸，逐漸開始下降，各IR組與sham相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(3)肝臟組織caspase-12活性：caspase-12在IR0h組開始升高，在IR6h達(dá)到高峰，隨后逐漸下降。(4)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78、ATF6、CHOP表達(dá)情況：GRP78、ATF6、CHOP在IR1h開始升高，IR6h開始升高較明顯，IR12h達(dá)到峰值，IR24h后有所下降，但仍處于較高表達(dá)水平。(5)細(xì)胞焦亡蛋白表達(dá)水平變化：

7、caspase-1、casepase-11在對照組肝臟組織中有基礎(chǔ)水平表達(dá)，在IR1h升高不明顯，IR6h開始表達(dá)明顯上升，IR12h達(dá)到峰值，IR24h后有所下降，但仍處于較高表達(dá)水平。(6)促炎因子IL-1β表達(dá)情況：IL-1β在Sham組肝臟組織中有基礎(chǔ)水平表達(dá)，IR1h開始升高，IR6h開始升高較顯著，IR12h達(dá)到峰值，IR24h后有所下降。
　　結(jié)論：(1)大鼠肝臟熱缺血再灌注損傷中，組織細(xì)胞損傷可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)(2

8、)大鼠肝臟缺血再灌注損傷中，除了壞死、凋亡等死亡方式外，還存在另一種新的程序性細(xì)胞死亡方式，即細(xì)胞焦亡，肝臟組織損傷可能與細(xì)胞焦亡有著一定的聯(lián)系。
　　第二部分 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白ATF6-CHOP在肝臟冷保存中對細(xì)胞焦亡的調(diào)控機(jī)制研究
　　目的: 探索在大鼠肝臟冷保存中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，以及探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對細(xì)胞焦亡可能存在的調(diào)控作用。
　　方法:(1)大鼠肝臟組織及正常大鼠肝臟細(xì)胞冷保存模型及分組

9、:①大鼠肝臟組織冷保存:選取18只SD雄性健康大鼠，體重約280-300g，建立大鼠肝臟冷保存模型。分為對照組(Normal組)，冷保存12小時組(CS12h組)，冷保存24小時組（CS24h組），每組6只大鼠，于相應(yīng)時間點(diǎn)收集肝臟組織;②正常大鼠肝臟細(xì)胞冷保存模型:培養(yǎng)大鼠正常肝臟細(xì)胞系BRL細(xì)胞，建立肝臟細(xì)胞冷保存模型，分為對照組（Sham組），冷保存12小時組（cs12h組），冷保存24小時組（cs24h組），于相應(yīng)時間點(diǎn)收集肝臟

10、細(xì)胞。(2)大鼠肝臟組織保存液本送西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，采用全自動生化分析儀檢測LDH的變化水平。(3)分別用2.5ug/ml的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激動劑衣霉素(tunicamycin，TM)和100uM的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑牛磺熊去氧膽酸(tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)單獨(dú)刺激大鼠肝臟BRL細(xì)胞，對照組加入等體積的二甲基亞砜(DMSO)，分別培養(yǎng)24h小時后收集樣品。免疫印跡技術(shù)(Western blot，W

11、B)檢測凋亡相關(guān)蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。(4)各組肝臟組織行HE染色，在光鏡下觀察組織病理變化，評估炎癥及組織壞死情況。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry，IHC)和免疫印跡（Western blot)法檢測各組焦亡相關(guān)蛋白caspase-1、caspase-11的表達(dá)情況;免疫印跡技術(shù)(Western blot，WB)檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-12，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白，促炎因子

12、IL-1β表達(dá)情況。以上方法收集到的數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）的形式來對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述，用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05時，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果: (1)①成功建立大鼠肝臟組織冷保存模型，各組病理學(xué)變化:實(shí)驗(yàn)各組均出現(xiàn)了不同程度的細(xì)胞水腫以及胞漿疏松化，伴有炎癥細(xì)胞浸潤，未發(fā)現(xiàn)組織壞死，以冷保存24h組肝臟組織損傷最重。肝臟組織冷保存中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況:caspase-12在

13、對照組中幾乎不表達(dá)，在肝臟組織冷保存12h后逐漸升高，24h達(dá)到高峰，與Normal組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。②內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78、ATF6、CHOP表達(dá)情況:GRP78、ATF6及CHOP在正常肝臟組織中微量表達(dá)，在冷保存12小時開始升高，24小時達(dá)到峰值。③焦亡相關(guān)蛋白caspase-1、casepase-11以及促炎因子IL-1β表達(dá)情況:caspase-1、casepase-11、IL-1β在對照組肝臟組織

14、中有基礎(chǔ)水平表達(dá)，冷保存12小時開始升高，24小時達(dá)到峰值，與對照組相比，差異顯著。(2)①大鼠肝臟BRL細(xì)胞經(jīng)冷保存后，凋亡相關(guān)蛋白caspase-12，細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白caspase-1、caspase-11，促炎因子IL-1β的表達(dá)，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯較對照組升高，且隨著冷保存時間的延長，其表達(dá)水平逐漸上升，與肝臟組織冷保存結(jié)果變化規(guī)律一致。②經(jīng)衣霉素處理后，細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白caspase-1、caspase-11、

15、IL-1B的表達(dá)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯均較對照組顯著升高，提示衣霉素誘導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，同時促進(jìn)了細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。③經(jīng)牛黃熊去氧膽酸處理后，caspase-1、caspase-11、IL-1β等蛋白，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78、ATF6、CHOP的表達(dá)較與對照組顯著下降，提示牛黃熊去氧膽酸抑制了肝臟冷保存過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，同時抑制了細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論: (1)大鼠肝臟冷保存中誘導(dǎo)了細(xì)胞凋