鼠李糖脂構(gòu)建逆膠束中木質(zhì)纖維素酶特性分析及其純化研究.pdf

1、木質(zhì)纖維素是世界上分布最廣的一種有機化合物，因為它的降解效率很低，所以成為全球碳循環(huán)過程的一個限制因素。木質(zhì)纖維素酶的生產(chǎn)和純化過程也十分緩慢并且產(chǎn)量不高，對于木質(zhì)纖維素這種逐年增加的“廢棄能源”來說，情況不容樂觀，逆膠束萃取法被證明是對于酶的萃取純化非常有效的方法之一。而逆膠束是通過表面活性劑的極性端和非極性端把水相和有機相結(jié)合起來的乳化結(jié)構(gòu)。由表面活性劑包裹起來的水核能夠增溶水溶性酶和其他的極性物質(zhì)，這使得逆膠束萃取法成為了一種相對

2、完美的液液生物萃取方法。而且，逆膠束的水核是在納米級別的尺寸，使得增溶進入水核的酶能夠保持較高和穩(wěn)定的活性，對于酶萃取來說是個良性優(yōu)越的環(huán)境。一般來說，逆膠束萃取主要包括兩個步驟，前萃和后萃，目前大多數(shù)的學者更多的關(guān)注前萃過程，因為后萃過程的進行相對來說較難，但是后萃過程也至關(guān)重要，因為這直接關(guān)系到最終產(chǎn)品的質(zhì)量。
　　目前，大量的國內(nèi)和國際的研究學者都在進行逆膠束萃取的研究，但是大多用的是化學表面活性劑來構(gòu)建逆膠束體系。這種表面

3、活性劑的來源相對有限，需要繁雜的工業(yè)生產(chǎn)，并且會給環(huán)境帶來大量的化工垃圾，而且有時候他們能夠使體系中的酶失活，降低酶萃取的效率。相對來說，目前越來越多人開始關(guān)注生物表面活性劑，因為它本身的可降解性和低毒性，同時能夠?qū)崿F(xiàn)體系物質(zhì)的重復(fù)利用，而且由生物表面活性劑構(gòu)建的逆膠束體系相對于化學表面活性劑來說，具有更好的增溶特性，不錯的環(huán)境相容性和相對溫和的反應(yīng)環(huán)境。目前，針對生物表面活性劑的研究都進展的非常順利，尤其是廣泛使用的鼠李糖脂。

4、　　在第一部分的研究中，對比三種化學表面活性劑(CTAB，AOT and Tween-80)，研究了在正己醇/異辛烷(1∶1，v/v)溶劑中，由鼠李糖脂構(gòu)建的逆膠束中水核的性質(zhì)還有其微環(huán)境的行為狀況。在這一部分的研究過程中，我們構(gòu)建了表面活性劑/正己醇/異辛烷/水逆膠束體系的三相圖，來了解在不同表面活性劑，不同組分比例情況下，體系中三種相之間的區(qū)域大小變化。同時利用紅外光譜儀在波段3050-3750 cm-1區(qū)域測了-OH基的紅外振動情

5、況，通過對于紅外光譜的分析來了解逆膠束水核中水的分布狀態(tài)，結(jié)合水和自由水的組成與水核大小的關(guān)系等等。而且也通過熒光法，測量了鼠李糖脂在逆膠束體系中的臨界膠束濃度為0.055 mM·L-1，表明即使很少劑量的鼠李糖脂也能形成逆膠束。另外，本實驗還測了逆膠束體系的電導(dǎo)特性，可以看出體系的含水率在35.1處，電導(dǎo)發(fā)生了突變，這個數(shù)值比其他的化學表面活性劑的高，說明系統(tǒng)能夠增溶更多的水。最后，還檢測了逆膠束水核的尺寸，我們發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂能夠大量的

6、提高逆膠束的增溶水能力，形成較大的膠束水核，從而為酶促反應(yīng)提供較好的微環(huán)境。
　　第二部分的研究，檢測了以愈創(chuàng)木酚為底物的漆酶在逆膠束體系中的酶活變化，主要通過紫外可見分光光度法來測得漆酶酶活。含水率對于酶活的影響主要呈現(xiàn)一個鐘鼎狀，先增大后減小，在ω0=19處取得酶活的最大。當水相的pH=5.2，[KCl]=0.05 mol·L-1，鼠李糖脂逆膠束體系漆酶活性能夠達到最優(yōu)狀態(tài)。另外，我們考察了不同介質(zhì)對于漆酶降解的動力過程的影響

7、，在逆膠束中酶活沒有在水介質(zhì)中高，但是在逆膠束體系中，鼠李糖脂逆膠束相對于其他化學表面活性劑依然有著較高的漆酶酶活，在鼠李糖脂濃度為0.055 mM/L取得酶活最大值。
　　在鼠李糖脂逆膠束體系中對于纖維素酶和LiP酶進行前萃過程的萃取，考察了體系中的萃取時間，pH，表面活性劑濃度和離子強度、種類對于萃取效果的影響，纖維素酶和LiP酶分別有各自萃取的優(yōu)化條件。LiP:[RL]=50 CMC，[KCl]=40 mmol/L，pH值為

8、3.0，振蕩時間為30 min，在KCl中有最高萃取效率;纖維素酶:[RL]=40 CMC，[KCl]=50 mmol/L，pH值為3.5，振蕩時間為30 min，在NaCl中有最高萃取效率。
　　在后萃過程中，接著前萃過程產(chǎn)生的萃余油相繼續(xù)將溶解在其中的酶分離出來到水相當中，同樣地，考察了萃取時間，pH，離子強度和種類以及外加溶劑對于后萃萃取效果的影響，在該后萃中兩種酶分別有各自后萃的相對最優(yōu)狀況。LiP:[KCl]=0.5 m

9、ol/L，pH值為7.0，振蕩時間為30 min，乙醇體積比為8％，在KCl中有最高萃取效率;纖維素酶:[KCl]=0.15 mol/L，pH值為7.0，振蕩時間為40 min，乙醇體系比為4％，在NaC1中有最高萃取效率。通過后萃過程的研究發(fā)現(xiàn)，外加醇類可以明顯的提高系統(tǒng)的酶活回收率，萃取率和純化倍數(shù)，并且能夠使得萃取過程更快更好。
　　總的來說，對于鼠李糖脂構(gòu)建的逆膠束體系來說，它能夠為酶促反應(yīng)和酶的液液純化萃取（包括前萃和后