纖維素酶吸附致鈍特性研究及其改造策略.pdf

1、蛋白質(zhì)在固-液界面處的吸附通常存在不可逆的吸附，這種不可逆的吸附在酶反應(yīng)體系中也經(jīng)常發(fā)生。在纖維素酶-纖維素水解體系中，由于纖維素的水不溶性形成了固體纖維素-液相兩相系統(tǒng)，纖維素酶吸附和水解作用是發(fā)生在固-液界面處的。借助表面等離子共振技術(shù)，在恒溫40℃的條件下觀察了外切纖維二糖水解酶I在纖維素表面的吸附特征并測定了吸附動力學(xué)數(shù)據(jù)。吸附在纖維素表面的纖維素酶CBH I在纖維素.液相界面處表現(xiàn)出部分不可逆的吸附特點(diǎn)。考慮到不可逆吸附的特點(diǎn)

2、，建立了能夠很好的描述纖維素酶在纖維素表面實(shí)際吸附過程的數(shù)學(xué)模型。其中模型的相關(guān)動力學(xué)參數(shù)：Kads，0.26(L·cm-2·s-1);Ktra，0.41(s-1)。為了評估纖維素酶吸附對酶水解纖維素的影響，使用纖維素CF11和纖維素酶CBH I反應(yīng)體系來測定反應(yīng)動力學(xué)動態(tài)變化。以不可逆吸附的纖維素酶CBH I的表面密度同反應(yīng)過程中的水解速率作圖，直觀的顯示了它們之間負(fù)相關(guān)的特點(diǎn)，即隨著反應(yīng)過程中表面密度的增加，纖維素的水解速率呈現(xiàn)下降

3、。發(fā)現(xiàn)纖維素酶CBH I的不可逆吸附同纖維素水解速率的變化相關(guān)，提出了產(chǎn)生這種結(jié)果的可能機(jī)制，同時提供了通過改變纖維素酶的不可逆吸附的特點(diǎn)來提高纖維素酶水解效率的思路。 開展了采用酶工程技術(shù)手段改善纖維素酶的特性的研究。首先考察了噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用于纖維素酶改造工程上的可行性。通過將來自瑞氏木霉的外切纖維素酶CBH I和內(nèi)切纖維素酶EG I的cDNA基因序列克隆到噬菌粒載體pCANTAB 5E中，分別構(gòu)建了重組噬菌粒載體pCAN

4、TAB-c6h I和pCANTAB-eg I。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在大腸桿菌TG1中得到表達(dá)，表達(dá)的纖維素酶連接著噬菌體基因3編碼的尾絲蛋白PⅢ，以融合蛋白的形式展示在噬菌體M13的表面。分別測定了對外切纖維素酶和內(nèi)切纖維素酶各自的水溶性底物pNPC和CMC的水解活性，表明噬菌體展示的纖維素酶依然保持酶水解活力。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明噬菌體展示的纖維素酶對濾紙纖維素有吸附活性?？傊?，噬菌體展示的纖維素酶依然保持它們的生物學(xué)功能，噬菌體展示系

5、可以用在纖維素酶工程上。利用隨機(jī)突變PCR技術(shù)結(jié)合噬菌體展示系統(tǒng)進(jìn)行了纖維素酶的定向進(jìn)化。通過優(yōu)化隨機(jī)突變PCR反應(yīng)體系條件和參數(shù)，在擴(kuò)增外切纖維素酶CBH I的基因時，PCR反應(yīng)體系中加入3％的DMSO,獲得高質(zhì)量的擴(kuò)增效果。擴(kuò)增的纖維素酶基因片段的突變頻率控制在4.5～5.1/Kb水平，對應(yīng)于蛋白質(zhì)的突變頻率發(fā)生數(shù)個氨基酸的變化，適合蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化研究。優(yōu)化了連接體系，克隆DNA片段同載體的摩爾比為5:1時連接效果最佳。改進(jìn)了利用

6、KOB培養(yǎng)基培養(yǎng)TG1制備高效電轉(zhuǎn)感受態(tài)的方法，獲得的感受態(tài)效率達(dá)到3×108～9/μg質(zhì)粒?；谶@些工作基礎(chǔ)，構(gòu)建的外切纖維素酶CBH I和內(nèi)切纖維素酶EG I的突變體庫的庫容都達(dá)到106克隆子水平。利用變性劑鹽酸胍處理噬菌體展示酶庫，在逐漸提高篩選壓力的過程中篩選掉穩(wěn)定性差的展示突變體。這為利用噬菌體展示突變體酶庫開展纖維素酶的定向進(jìn)化研究打下了基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步拓展新型纖維素酶的篩選范圍，利用表型特征以及系統(tǒng)進(jìn)化分析和分子生物學(xué)的方

7、法鑒定了一株源自招遠(yuǎn)金礦酸性水樣的細(xì)菌ZY-1，并分析了其在分類學(xué)上的地位。根據(jù)16S rDNA序列，菌株ZY-1在進(jìn)化親緣關(guān)系上同Acidiphilium屬的一些種較近，同Acidiphilium cryptum和Acidiphilium multivorum聚在同一個亞類中。菌株ZY-1的細(xì)胞脂肪酸以直鏈、支鏈、不飽和脂肪酸的形式存在。其中，菌株ZY-1的脂肪酸主要是以飽和脂肪酸為主，但也含有一定量的不飽和脂肪酸18:1ω9t，以及

8、i16:0支鏈脂肪酸，少量帶有一個環(huán)丙烷的脂肪酸19:0cycloω9c。雖然菌株ZY-1的16S rDNA序列同A.cryptum和A.multivorum的相似度為99％，但是在生理生化以及形態(tài)特征上并不一致。菌株ZY-1生長溫度范圍28～42℃，最適生長溫度約在37℃。生長的pH值范圍2.0～4.0，最適生長pH在3.0附近。ZY-1的菌落呈白色，光滑，凸起，最大直徑1mm。革蘭氏陰性，短棒狀。碳源利用分析表明在耗氧條件下能夠以多

9、種營養(yǎng)物為唯一碳源進(jìn)行異養(yǎng)生活。以含有不同碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)時，菌株ZY-1表現(xiàn)出不同的菌體特征，當(dāng)以葡萄糖為唯一碳源進(jìn)行培養(yǎng)時，菌體的表面比較光滑。但是當(dāng)在纖維素為唯一碳源培養(yǎng)時，菌體的表面分布有很多突起物。這也是首次在Acidiphilium屬中發(fā)現(xiàn)能夠利用纖維素的菌株。通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，嗜酸菌ZY-1菌體表面在降解纖維素時生長的突起物和報道的纖維小體較為類似。另外，也分離出一株能夠利用纖維素的真菌ZY-E1，經(jīng)表型分析和18S