膽囊ICC細(xì)胞在慢性結(jié)石性膽囊炎的變化與動(dòng)力學(xué)改變及茵陳蒿湯的干預(yù)作用.pdf

1、背景:
　　膽囊是膽道系統(tǒng)重要的組成部分，膽囊的收縮功能是通過神經(jīng)調(diào)節(jié)和體液調(diào)節(jié)的雙重支配下完成的，其中體液調(diào)節(jié)是占有主導(dǎo)地位，膽囊收縮素(CCK)分泌的控制直接參與膽道運(yùn)動(dòng)，且作用尤為重要，并被認(rèn)為是最主要的方式(1)。在膽囊自主性的收縮過程中，膽囊所表現(xiàn)出的自發(fā)性興奮性在心臟、胃腸道這些同樣具有自發(fā)性興奮性的器官之間都具有相同的聯(lián)系和特點(diǎn)，并可以聯(lián)系到某些特殊分化的細(xì)胞群。Hinescu ME(2)首次發(fā)現(xiàn)膽道ICC的存在后，

2、近年來研究大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為膽道系統(tǒng)ICCs樣細(xì)胞與膽囊能產(chǎn)生和傳播自發(fā)性節(jié)律、調(diào)節(jié)膽囊運(yùn)動(dòng)、引起膽囊收縮等功能密切聯(lián)系(3,4)。
　　目前對胃腸道ICC已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究和證明，并且證實(shí)是引起膽囊排空障礙的初始和關(guān)鍵動(dòng)力學(xué)因素(6)，參與著胃腸道神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)過程，具有起搏胃腸平滑肌運(yùn)動(dòng)，傳遞者胃腸道信號(7)的功能。膽囊壁與胃腸壁結(jié)構(gòu)類似，胃腸道中的ICC與膽囊中的ICC是否分布和形態(tài)都類似，我們提出調(diào)節(jié)機(jī)制上是否也相互關(guān)聯(lián)的

3、猜想，諸如這些問題指引著我們從細(xì)胞層面去分析膽道系統(tǒng)中的ICC細(xì)胞，并通過ICC與膽囊動(dòng)力變化的相互關(guān)系的角度去研究。
　　在多數(shù)胃腸道疾病中，大部分疾病的發(fā)生總是伴隨著ICC的減少或缺失，并且首先被人們與運(yùn)動(dòng)相關(guān)性疾病聯(lián)系起來，如慢性傳輸型便秘、糖尿病性胃輕癱(5,8)，在膽道系統(tǒng)中最常見的就是膽石癥。膽石癥其發(fā)病機(jī)制除了“膽汁中膽固醇過于飽和”和“膽固醇微結(jié)晶成核時(shí)間縮短”這兩種理論支持外，膽囊自身的因素中自身運(yùn)動(dòng)能力減弱的作

4、用也越發(fā)突出(9)。慢性結(jié)石性膽囊炎在中醫(yī)中屬于“膽脹”、“黃疸”等范疇，病機(jī)上屬于肝膽濕熱證，治則為清熱除濕、疏肝利膽、通降排石。茵陳蒿湯源于張仲景《傷寒論》辨陽明病脈證并治篇，由茵陳、梔子、大黃三味中藥組成。該方藥在經(jīng)方中為治療陽黃的經(jīng)典方，但實(shí)踐證明(10)，無黃疸而有肝膽濕熱證者，用之療效更加顯著。本課題組研究表明運(yùn)用茵陳蒿湯對慢性結(jié)石性膽囊炎有明顯緩解作用，該方藥針對疾病產(chǎn)生過程中動(dòng)力改變的之間的聯(lián)系，ICC細(xì)胞與慢性結(jié)石性膽

5、囊炎之間的聯(lián)系，有待于我們進(jìn)一步的研究。
　　目的:
　　第一部分:應(yīng)用茵陳蒿湯治療慢性結(jié)石性膽囊炎患者療效以及膽囊收縮功能影響的分析。
　　第二部分:給予動(dòng)物膽固醇混合入常規(guī)飼料的方法，建立慢性結(jié)石性膽囊炎模型，造模時(shí)間為八周。并對其中治療組給予高膽飼料八周的同時(shí)灌胃茵陳蒿湯。各組分別進(jìn)行膽囊HE染色、透射電鏡、膽囊肌條測定肌張力，及Cajal間質(zhì)細(xì)胞的提取培養(yǎng)后，光鏡和熒光顯微鏡下的觀察。
　　1.觀察正常組

6、、高膽組和治療組HE染色后表現(xiàn)出的炎癥情況的變化，以及透射電鏡下ICC細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變;
　　2.觀察三組膽囊肌條在膽囊收縮素刺激下，膽囊肌條的肌張力變化情況;
　　3.觀察原代提取后培養(yǎng)的Cajal間質(zhì)細(xì)胞，光鏡和熒光顯微鏡下形態(tài)觀察。
　　方法:
　　第一部分:
　　1.采集大連醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2010年1月至2011年12月之間的門診和住院患者標(biāo)本，根據(jù)疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)選定入選的標(biāo)本和排出指標(biāo)下的標(biāo)

7、本例數(shù)，確定入組病例。
　　1.1治療組:28例，男性18例，女性10例，年齡35至60歲，平均50.9±20.1歲。
　　1.2對照組:30例，男性21例，女性9例，年齡25至60歲，平均52.7±18.8歲。
　　2.兩組患者通過門診接診或住院后給予抗感染、糾正電解質(zhì)紊亂的治療后，對照組口服安慰劑（涼茶），治療組口服中藥湯劑茵陳蒿湯。觀察兩組的臨床表現(xiàn)，將數(shù)據(jù)錄入數(shù)據(jù)庫中做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并對其療效做出評價(jià)。
　

8、　3.統(tǒng)計(jì)對照組及受檢患者治療前后使用B超檢測膽囊收縮功能的方法測出的空腹?fàn)顟B(tài)下的膽囊容積、進(jìn)食脂肪餐后的膽囊容積以及膽囊收縮率，并將上述數(shù)據(jù)也錄入數(shù)據(jù)庫中作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　4.對對照組以及受檢患者治療前后膽囊收縮率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，觀察患者與對照組人員上述指標(biāo)的差異以及患者治療前后上述指標(biāo)的變化。
　　第二部分:
　　1.將試驗(yàn)用普通級豚鼠，兩到三個(gè)月齡，均為雄性，體重在200-250g，隨機(jī)分為正常組、模型組和治療

9、組。正常組給予標(biāo)準(zhǔn)豚鼠飼料，模型組和治療組給予配制好的高膽固醇致石飼料，共同飼養(yǎng)時(shí)間維持8周，8周后治療組使用茵陳蒿湯進(jìn)行灌胃，正常組和模型組使用相同體積的生理鹽水替代中藥做對照，并繼續(xù)之前的飼養(yǎng)計(jì)劃，一共施行4周。
　　2.取各組膽囊組織，制作成冰凍切片，經(jīng)過脫水、染色、分化等步驟對其進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察各組膽囊切片呈現(xiàn)出的病理學(xué)改變，在高倍鏡和低倍鏡下分別照片，利用獨(dú)立雙盲原則請病理學(xué)老師評定各組的膽囊炎癥程度，驗(yàn)證膽囊模

10、型的建立是否成功。
　　3.取各組膽囊組織，通過雙固定、乙醇梯度脫水、包埋、切片、染色等步驟，在透射電鏡下觀察ICC細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。
　　4.取各組膽囊組織，制成膽囊肌條連接張力換能器，在膽囊收縮素的刺激下，通過多通道生物信號采集分析系統(tǒng)，記錄三組膽囊肌條收縮活動(dòng)的頻率和幅度。
　　5.取各組膽囊組織無菌條件下剪成組織塊，通過膠原酶消化法制成細(xì)胞懸液，接種至培養(yǎng)基培養(yǎng)3-5d后，進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光鑒定。
　　結(jié)果:<

11、br>　　第一部分:
　　1.治療組臨床總有效率達(dá)75％，對照組總有效率達(dá)12.1％，治療組明顯優(yōu)于對照組(P＜0.05)。結(jié)論表明茵陳蒿湯在治療慢性結(jié)石性膽囊炎臨床療效方面具有較好作用。
　　2.1所選慢性結(jié)石性膽囊炎患者治療前膽囊收縮率較對照組膽囊收縮率顯著下降(P＜0.05)，其膽囊收縮功能表現(xiàn)為不良狀態(tài)。
　　2.2服用茵陳蒿湯治療后，受檢慢性結(jié)石性膽囊炎患者膽囊收縮功能得到顯著升高(P＜0.05)。
　

12、　第二部分:
　　1.HE染色在光鏡下觀察三組炎性程度有明顯差異;ICC細(xì)胞在電鏡下的超微結(jié)構(gòu)以及與周圍平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞之間的縫隙連接結(jié)構(gòu)均有的不同。
　　2.膽囊肌條實(shí)驗(yàn)中，模型組較正常組收縮幅度和頻率上有明顯下降(P＜0.05)，治療組相對模型組收縮幅度和頻率上有明顯的上升(P＜0.05)。
　　3.膽囊ICC細(xì)胞能在原代提取的情況下在體外穩(wěn)定培養(yǎng)，并可以傳代2-3次，通過c-kit免疫熒光染色鑒定將ICC細(xì)胞