文昌雞性成熟啟動前后下丘腦部分功能基因和miRNA表達譜的變化.pdf

1、性早熟在人類上表現(xiàn)為病理狀態(tài)，而在家禽生產(chǎn)上則是一個具有重要經(jīng)濟價值的性狀。我國地方雞品種資源的早熟特性十分明顯，開展雞性成熟調(diào)控機制研究，對于高產(chǎn)蛋雞和優(yōu)質(zhì)肉雞育種具有重要意義。同時，雞作為重要的模式生物，其早熟性相關(guān)研究也可為人類性早熟疾病臨床診斷、治療提供科學依據(jù)。
　　性成熟啟動是一個復雜的生物學過程，決定性成熟啟動的關(guān)鍵性事件是下丘腦GnRH脈沖式釋放增加。近年來研究發(fā)現(xiàn)，諸多功能基因和調(diào)節(jié)因子參與了性成熟啟動，性成熟啟

2、動基因的轉(zhuǎn)錄抑制可能起到了重要作用，防止了性成熟的過早發(fā)生;模式生物和哺乳動物（包括人類）發(fā)育時機研究提示miRNA和性成熟啟動之間有潛在聯(lián)系;進入血液循環(huán)的外泌體所裝載的miRNA能在血清（漿）中穩(wěn)定存在，并且其拷貝數(shù)變化能反映機體生理和病理狀態(tài)改變，是一種新型生物標志物。
　　本論文選取早熟地方雞品種文昌雞為實驗素材，主要開展了以下幾個方面的研究:(1)測定不同發(fā)育時期文昌雞母雞雞冠、性腺組織的發(fā)育性變化和血清LH濃度變化，度

3、量文昌雞母雞的性成熟啟動時機，為構(gòu)建性成熟啟動前、后高通量測序文庫提供基礎(chǔ)。(2)利用qRT-PCR技術(shù)檢測了c-Myc/LIN28/let-7通路、POK/PcG/TRG通路部分功能基因在性成熟啟動前、后文昌雞下丘腦中的表達變化規(guī)律。(3)利用Solexa高通量測序技術(shù)檢測了雞性成熟啟動前、后下丘腦中miRNA表達譜，結(jié)合生物信息學分析，探討miRNA在雞性成熟啟動調(diào)控中的作用。(4)利用Solexa高通量測序技術(shù)檢測了雞性成熟啟動前

4、、后血清（漿）中miRNA表達譜，篩選差異表達miRNA，并利用qRT-PCR技術(shù)檢測候選miRNA在性成熟啟動及進程中的表達規(guī)律，建立雞性成熟啟動度量特異性循環(huán)miRNA標記檢測技術(shù)。
　　綜合本論文的研究結(jié)果，主要得出以下結(jié)論:
　　(1)性成熟啟動時機度量
　　在發(fā)育早期，文昌雞雞性腺組織發(fā)育緩慢，卵泡保持原始狀態(tài)，這一過程約持續(xù)12周。12周齡后，性腺組織進入快速發(fā)育期，13周齡母雞的卵巢重量(1.35g)和輸

5、卵管長度(15.68cm)與12周齡測量值(0.60g、7.16cm)相比，分別增加了125％和120％，同時出現(xiàn)等級前小白卵泡（SWF，直徑1.0～2.0mm）或大白卵泡（LWF，直徑3.0～5.0mm)。LH水平的增加與性腺組織的快速發(fā)育相一致，LH水平在13周齡顯著增加(P＜0.01)，并在14～15周齡達到峰值，至開產(chǎn)后下降至較低水平。確定了13周齡為文昌雞母雞的性成熟啟動關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點，這為構(gòu)建性成熟啟動前、后高通量測序文庫提供了

6、前提。
　　(2)性成熟啟動調(diào)節(jié)通路功能基因表達規(guī)律
　　qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)c-Myc、LIN28B基因在文昌雞性成熟啟動關(guān)鍵時機（12周齡至13周齡）下丘腦組織中的表達水平顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)，且c-Myc基因的低表達能夠持續(xù)到開產(chǎn)，而LIN28B基因表達水平在開產(chǎn)前（15周齡）又恢復至較高水平;與之相對應的是，Solexa高通量檢測發(fā)現(xiàn)性成熟啟動后let-7a、let-7b和let-7g表達水平升高

7、。BCL6、ZBTB7A基因在性成熟啟動前期下丘腦中的表達水平較低，性成熟啟動后BCL6基因表達水平顯著升高(P＜0.01)，ZBTB7A基因表達水平雖有所升高，但與前期相比差異并不顯著(P＞0.05)，其表達水平的顯著性變化(P＜0.01)發(fā)生在15周齡，且在開產(chǎn)后仍維持較高水平。YY1、EED基因在性成熟啟動前期下丘腦中的表達水平較高，性成熟啟動后表達水平顯著降低(P＜0.01)，且這種低水平表達僅維持2～3周，15周齡后又恢復至較

8、高水平，并持續(xù)至開產(chǎn)。Oct-1基因在文昌雞性成熟啟動前期下丘腦中的表達水平較低，性成熟啟動后表達水平顯著升高(P＜0.01)，且至開產(chǎn)仍保持較高水平，而TT1基因表達水平在性成熟啟動后顯著降低(P＜0.01)?？傮w上，研究結(jié)果支持基于哺乳動物數(shù)據(jù)構(gòu)建的多層次等級基因調(diào)節(jié)通路模式，即c-Myc(↓)→LIN28(↓)┤ let-7(↑)，POK(↑)┤PcG(↓)┤TRG(↑)（→表示促進作用，┤表示抑制作用），進一步證實了該調(diào)控通路與

9、性成熟啟動調(diào)節(jié)相關(guān)。推測通路調(diào)節(jié)功能在脊椎動物、哺乳動物（包括人類）進化上是保守的，多層次等級基因轉(zhuǎn)錄抑制作用可能防止了性成熟的過早發(fā)生。
　　(3)性成熟啟動前后下丘腦miRNA表達譜
　　通過高通量測序，在雞下丘腦中鑒定出374個已知miRNA、46個新miRNA，144個已知miRNA(reads＞10)的表達水平在性成熟啟動前后發(fā)生了顯著改變(P＜0.05)。5個差異表達miRNA被qRT-PCR方法進一步驗證。15

10、個差異最顯著miRNA(| log2(fold-change)|＞2.0，P＜0.01)預測到2013個靶基因，其中7個時鐘基因Per2、Bmal1/2、Clock、Cry1/2和Star被差異miRNA靶向多次，qRT-PCR檢測表明這些時鐘基因的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平在性成熟啟動后下丘腦中顯著升高(P＜0.01)。GO富集和KEGG調(diào)節(jié)通路分析結(jié)果表明，這些差異表達miRNA在性成熟啟動轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導通路中發(fā)揮了重要作用。表明miRNA是

11、參與雞性成熟啟動新的調(diào)節(jié)因子。鑒于miRNA功能的保守性，該研究結(jié)果將為深入開展動物（包括人類）性成熟的分子調(diào)控機制研究提供新的理論依據(jù)。
　　(4)性成熟啟動前后循環(huán)miRNA表達譜和循環(huán)miRNA標記
　　通過高通量測序，在血清、血漿中鑒定出共表達miRNA192個，血清中特異性表達miRNA1個，血清中特異性表達miRNA4個，新發(fā)現(xiàn)miRNA19個(reads＞10)。針對同一miRNA，在相同發(fā)育時期血清、血漿中的

12、表達豐度基本一致。性成熟啟動前、后血清中差異表達miRNA(P＜0.05)有130個，其中表達上調(diào)的有68個，下調(diào)的有62個。40個差異表達miRNA(|log2(fold-change)|＞1.0，P＜0.01）預測到4829個差異表達基因。GO富集和KEGG調(diào)節(jié)通路分析結(jié)果表明，這些差異表達miRNA主要參與蛋白水解、卵母細胞分裂、MAPK信號傳導及基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄等通路。qRT-PCR檢測結(jié)果表明，let-7a、miR-29c-3p、mi

13、R-217-5p、miR-375、miR-215-5p、miR-155、miR-9-5p、miR-19b-3p和miR-133a-3p等9個候選miRNA在性成熟啟動時機（12至13周齡轉(zhuǎn)變）表達變化趨勢與Solexa測序結(jié)果基本一致。候選miRNA在性成熟啟動前期血清中表達水平基本一致，就性成熟啟動時機（12至13周齡轉(zhuǎn)變）而言，miR-29c-3p(p=0.000)、miR-375(p=0.002)、miR-215-5p(p=0.0

14、13)、miR-9-5p(p=0.034)、miR-19b-3p(p=0.008)、miR-133a-3p(p=0.006)和let-7a(p=0.002)的表達水平顯著升高，miR-217-5p(p=0.112)和miR-155(p=0.174)的表達水平并未發(fā)生顯著性變化，基于這7個候選miRNAs組成的特異性新型標記可用于文昌雞性成熟啟動時機的精確度量。鑒于miRNA功能的保守性，這些循環(huán)miRNA標記可以為其它動物性成熟啟動度量