五谷蟲促進創(chuàng)面愈合作用及其機制的實驗研究.pdf

1、近年來,隨著抗生素濫用情況的日益嚴(yán)重,由耐藥菌引起的嚴(yán)重感染性創(chuàng)面逐漸增多,臨床缺乏有效的治療手段。由于此類創(chuàng)面愈合的病程長、并發(fā)癥多,嚴(yán)重影響了患者的健康和生活質(zhì)量,給社會帶來巨大負(fù)擔(dān)。中國傳統(tǒng)中藥“五谷蟲”,為麗蠅科絲光綠蠅、大頭金蠅的幼蟲。《本草綱目》、《本草求原》均記載:該蟲性寒無毒,可搽敷外用,能治療臁瘡等外科疾病。五谷蟲療法,是近年來興起的有效治療耐藥菌引起的嚴(yán)重感染創(chuàng)面的新型生物治療方法,即臨床上應(yīng)用活體無菌麗蠅科絲光綠蠅

2、幼蟲,來治療耐藥菌感染創(chuàng)面,已取得滿意效果,其作用機制主要包括:生物清創(chuàng)、抗菌和促進創(chuàng)面愈合。
　　 本課題組前期研究已經(jīng)證實,五谷蟲對感染創(chuàng)面起到抗菌作用的有效成分為具有生物活性的抗菌肽類蛋白。但是目前對五谷蟲促進創(chuàng)面愈合作用有效成分的功能學(xué)研究尚無報道,仍存在以下尚未解決的問題:
　　 (1)目前國際上應(yīng)用活體五谷蟲生物清創(chuàng)的同時,利用活體五谷蟲分泌的活性成分,控制創(chuàng)面的細(xì)菌感染;而我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)記載五谷蟲作為一種中藥

3、,經(jīng)過炮制后,使用其干粉外敷,同樣可以促進創(chuàng)面的愈合。但是尚缺乏活體五谷蟲有效成分和五谷蟲干粉的比較研究;(2)皮膚創(chuàng)面愈合病理過程復(fù)雜,涉及修復(fù)細(xì)胞的遷移、創(chuàng)面血管生成和局部神經(jīng)再生等多個過程。關(guān)于五谷蟲有效成分對上述愈合過程的影響機制尚不清楚;(3)五谷蟲在中藥學(xué)作為一種動物中藥,其成分復(fù)雜,大多為大分子化合物,分離分析難度較大,這大大的限制了五谷蟲干粉在臨床上的應(yīng)用,遠遠落后于臨床上對活體五谷蟲的應(yīng)用。因此,對待動物藥,必須在理論

4、和方法上有所創(chuàng)新,研究和開發(fā)其有效成分。
　　 為了解決以上幾個問題,本課題從多種五谷蟲有效成分獲取方式出發(fā),采用組織形態(tài)學(xué)、藥物化學(xué)、藥物分析及分子生物學(xué)方法,比較了五谷蟲有效成分不同獲取方式對創(chuàng)面愈合過程的影響,并對其有效組分進行提取、分析,尋找五谷蟲對創(chuàng)面愈合有促進作用的有效成分,并明確其作用機制以及可能參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　 本課題研究分三個部分:(1)五谷蟲成分不同獲取方式對創(chuàng)面愈合作用的比較研究;(2)活

5、體五谷蟲成分對創(chuàng)面愈合的促進作用及其機制研究;(3)中藥五谷蟲脂肪酸組分對創(chuàng)面愈合的促進作用及其機制研究。
　　 1.五谷蟲成分不同獲取方式對創(chuàng)面愈合作用的比較研究
　　 本部分選用了活體五谷蟲的勻漿產(chǎn)物和中藥五谷蟲干粉為研究對象,對比兩種使用方法對大鼠皮膚創(chuàng)面愈合過程的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn):創(chuàng)傷后第1和第3天五谷蟲勻漿物組、五谷蟲干粉組和對照組創(chuàng)面愈合率無顯著性差異(P＞0.05);創(chuàng)傷后第7,10和14天五谷蟲勻漿物組和五

6、谷蟲干粉組的創(chuàng)面愈合率高于對照組(P＜0.05),五谷蟲勻漿物組和五谷蟲干粉組創(chuàng)面愈合率無顯著性差異(P＞0.05)。組織學(xué)觀察顯示:在創(chuàng)面修復(fù)過程中,勻漿物組、干粉組與對照組相比,肉芽組織成熟,血管垂直于創(chuàng)面生長,膠原纖維排列整齊,瘢痕窄,成縱行條帶,可見再生的皮膚附屬器,再生上皮厚,爬行距離遠。因此,活體五谷蟲勻漿物和中藥五谷蟲干粉都可以減少大鼠皮膚創(chuàng)面的愈合時間、提高創(chuàng)面的愈合率和愈合質(zhì)量。
　　 2.活體五谷蟲成分對創(chuàng)面

7、愈合的促進作用及其機制研究
　　 (1)五谷蟲分泌物對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的影響及機制研究
　　 本實驗部分以活體五谷蟲的分泌物(ES)為研究對象,應(yīng)用體外創(chuàng)面愈合模型,研究分泌物對人微血管內(nèi)皮細(xì)胞系(HMEC-1)遷移和增殖的影響,以及參與的信號通路。MTT法檢測ES對內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響,結(jié)果顯示:雖然在10μg/ml ES下,內(nèi)皮細(xì)胞活力最大,但不同濃度ES對細(xì)胞活力無明顯影響(P＞0.05);進一步應(yīng)用體外創(chuàng)面愈

8、合模型和Transwell法,結(jié)果顯示:10μg/ml ES可促進內(nèi)皮細(xì)胞遷移;應(yīng)用Western-blot技術(shù)結(jié)果表明,ES可以誘導(dǎo)HMEC-1細(xì)胞發(fā)生遷移,并且時間依賴性激活A(yù)KT1,而不是ERK1/2。另外,應(yīng)用P13K抑制劑LY294002,可以部分降低ES誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移,完全地抑制ES誘導(dǎo)的AKT1激活。因此,ES對人微血管內(nèi)HMEC-1的遷移具有促進作用,而對增殖無影響;ES誘導(dǎo)HMEC-1的遷移作用,主要是激活PI3K/A

9、KT1通路,而非ERK1/2 MAPK通路。
　　 (2)五谷蟲勻漿物對創(chuàng)面神經(jīng)再生的影響
　　 本實驗部分以活體五谷蟲的勻漿物作為研究對象,研究五谷蟲的勻漿物對大鼠皮膚創(chuàng)面P物質(zhì)(SP)分泌和蛋白基因產(chǎn)物9.5(PGP9.5)表達的影響,進而探討五谷蟲勻漿物促進創(chuàng)面愈合的機制及它對創(chuàng)面神經(jīng)再生的影響。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:創(chuàng)傷后第3,7和10天,五谷蟲勻漿物組SP表達的面積、平均光密度和積分光密度均高于對照組(P＜0.

10、05);創(chuàng)傷后第7和10天,PGP9.5表達在再生神經(jīng)中,五谷蟲勻漿物組表達多于對照組(P＜0.05),創(chuàng)傷后第14天,五谷蟲勻漿物組內(nèi)真皮淺層仍見PGP9.5表達在再生神經(jīng)中,而對照組未見表達。因此,活體五谷蟲勻漿物可以促進創(chuàng)面SP和PGP9.5的表達,并且可能通過促進大鼠皮膚創(chuàng)面神經(jīng)再生,進而促進創(chuàng)面愈合。
　　 3.中藥五谷蟲脂肪酸組分對創(chuàng)面愈合的促進作用及其機制研究
　　 本部分應(yīng)用藥物化學(xué)提純方法,提取五谷蟲干

11、粉中的脂肪酸成分,應(yīng)用大鼠創(chuàng)面愈合模型,明確該脂肪酸提取物與創(chuàng)面愈合和血管生成之間的關(guān)系,尋找五谷蟲的有效成分組。結(jié)果顯示:創(chuàng)傷后第7天和第10天,五谷蟲提取物可提高創(chuàng)面愈合率(P＜0.05);免疫組織化學(xué)顯示:創(chuàng)傷后第3天,五谷蟲提取物可促進創(chuàng)面微血管密度(MVD)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)的表達(P＜0.05);RT-PCR和Western-blot顯示:創(chuàng)傷后第3天,五谷蟲提取物可促進VEGFA基因和蛋白的表達(P＜0.0