低氧對(duì)LO2細(xì)胞脂肪代謝的影響及其可能機(jī)制.pdf

1、研究背景與目的：
　　隨著人們生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfatty liver disease，NAFLD)發(fā)病率逐漸升高，已經(jīng)嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。肥胖、高脂血癥、胰島素抵抗/2型糖尿病等均為NAFLD明確的易患因素。然而，近年來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道，阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep apnea syndrome，OSAS)患者常伴有明顯肝損傷，認(rèn)為與呼吸暫停所致低氧誘導(dǎo)的

2、肝臟脂肪變性有關(guān)[1-2]。目前，有關(guān)低氧情況下肝臟脂代謝異常的機(jī)制仍不十分清楚，報(bào)道甚少。本研究擬通過(guò)低氧培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞株L02細(xì)胞，觀察肝細(xì)胞脂代謝相關(guān)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding protein，SREBP)-1、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)及低氧相關(guān)低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)2α、脂肪分化

3、相關(guān)蛋白(adiposedifferentiation-related protein，ADFP)的表達(dá)變化，探討低氧對(duì)肝細(xì)胞脂代謝的影響及其可能機(jī)制，可能為NAFLD提供新的治療靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)：用RPMI1640培養(yǎng)液(含10％胎牛血清、0.0625g/L青霉素、0.1g/L鏈霉素)培養(yǎng)肝L02細(xì)胞。
　　2、實(shí)驗(yàn)分組：結(jié)合文獻(xiàn)[3]，實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組(21％O2常氧培養(yǎng))、低氧組(1％O2低氧培養(yǎng)

4、)。
　　3、低氧模型的建立：MTT比色法檢測(cè)1％低氧對(duì)L02細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，確定低氧培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)。
　　4、通過(guò)L02細(xì)胞內(nèi)TG測(cè)定和油紅O染色了解其脂變情況；RT-PCR法檢測(cè)HIF-2α、SREBP-1 mRNA的表達(dá)；Western Blot法檢測(cè)SREBP-1、FAS、HIF-2α、ADFP的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、成功建立低氧誘導(dǎo)的肝L02細(xì)胞脂肪變性模型。隨著低氧暴露時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，肝細(xì)胞脂肪

5、變程度逐漸加重。
　　1)低氧模型的建立：將細(xì)胞放入溫度為37℃含有1％O2、5％CO2、94％N2飽和濕度的三氣培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24、48h。
　　2)TG測(cè)定：與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，低氧處理各時(shí)間點(diǎn)TG含量均增加，其中12h點(diǎn)，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，24、48h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；且低氧處理時(shí)間越長(zhǎng)，TG含量越多(F=115.04，P<0.01)。
　　3)油紅O染

6、色：對(duì)照組僅見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)少量橘紅色脂滴，而各低氧處理組隨著低氧培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量增多，且出現(xiàn)脂滴融合現(xiàn)象。
　　2、各組細(xì)胞內(nèi)SREBP-1、FAS的表達(dá)情況。
　　低氧12、24、48h各時(shí)間點(diǎn)SREBP-1 mRNA和蛋白、FAS蛋白表達(dá)均較對(duì)照組下調(diào)(P值均<0.01)。
　　3、各組細(xì)胞內(nèi)HIF-2α、ADFP的表達(dá)變化。
　　各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)均可檢測(cè)到HIF-2α mRNA的表達(dá)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

7、。常氧組細(xì)胞中未檢測(cè)到HIF-2α蛋白表達(dá)，低氧處理3h后HIF-2α蛋白表達(dá)逐漸增加，6h后達(dá)高峰，12、24h又逐漸降低(F=85.30。P<0.01)；與對(duì)照組比較，低氧12、24、48h各時(shí)間點(diǎn)ADFP蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)(P值均<0.05)，且隨低氧時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸增多(F=167.49，P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、SREBP-1-FAS生脂途徑可能沒(méi)有參與低氧介導(dǎo)的肝細(xì)胞脂變。
　　2、HIF-