NH4Cl對(duì)人肝細(xì)胞系LO2氨轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白R(shí)HCG和AQP8表達(dá)的影響.pdf

1、背景
　　肝臟是人體物質(zhì)代謝的重要器官，具有代謝、解毒、排泄等重要功能。當(dāng)肝臟發(fā)生嚴(yán)重病變時(shí)（如肝硬化、肝癌、重型肝炎），會(huì)嚴(yán)重影響機(jī)體正常的生理功能[1]。臨床工作中，血氨(bloodammoniaBA)對(duì)肝代謝功能的指示作用備受關(guān)注，其不僅可以反映肝病嚴(yán)重程度，還可以診斷肝性腦病。血氨的正常值是18～72umol/L，主要來(lái)源于腎臟分泌氨、腸道產(chǎn)氨、肌肉產(chǎn)氨等[2]。正常情況下體內(nèi)氨主要代謝途徑是在肝臟中被合成尿素，然后經(jīng)腎臟

2、被排出體外。氨在腦、心肌、骨髂肌中的代謝途徑，則是在谷氨酰胺合成酶的催化作用下被合成谷氨酰胺，然后經(jīng)血液循環(huán)將合成的谷氨酰胺運(yùn)輸?shù)礁闻K，再經(jīng)谷氨酰胺酶分解作用產(chǎn)生氨，最后被分解出來(lái)的氨在肝臟中參與尿素合成的鳥(niǎo)氨酸循環(huán)。當(dāng)肝臟代謝出現(xiàn)病變時(shí)，其不能夠有效地代謝體內(nèi)產(chǎn)生的氨，致使氨的積累，從而進(jìn)一步加重肝臟的病變，引起更嚴(yán)重的病癥，如肝性腦病，甚至發(fā)生肝衰竭。與此同時(shí)，肝臟的損傷也會(huì)導(dǎo)致氨在體內(nèi)的積聚，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生較多影響，主要包括以下幾個(gè)方

3、面:1.氨引起星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹;氨在體內(nèi)、外均可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹。臨床研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹是急性肝衰竭時(shí)腦水腫重要的細(xì)胞病理指標(biāo)。2.由氨引起的能量代謝障礙。3.由氨引起的線粒體通透性轉(zhuǎn)換。4.由氨引起的氧化應(yīng)激效應(yīng)[3-5]。
　　最新研究發(fā)現(xiàn)，一類專性介導(dǎo)氨轉(zhuǎn)運(yùn)的RH蛋白、甲氨透明質(zhì)酸MEP(mythylaminepermease)和氨運(yùn)載體AMT(ammoniumtransporter)共同構(gòu)成了參與氨轉(zhuǎn)運(yùn)的超級(jí)蛋

4、白家族。三種蛋白存在的主要位置有一定區(qū)別，其中RH糖蛋白主要表達(dá)于動(dòng)物，MEP主要在酵母菌中表達(dá)，而AMT則主要表達(dá)于植物。RH糖蛋包括RHAG、RHBG、RHCG，其中RHAG為紅系相關(guān)性蛋白，RHBG和RHCG為非紅系相關(guān)性蛋白。然而，在人體內(nèi)各器官中氨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要為RHBG和RHCG。有研究發(fā)現(xiàn)RHBG和RHCG在腎臟和肝臟的氨的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)中起關(guān)鍵作用[6]。此外還發(fā)現(xiàn)一組對(duì)水具有高選擇性的蛋白——水通道蛋白(AQP)，該蛋白主要

5、負(fù)責(zé)水的分泌吸收和維持細(xì)胞內(nèi)外的水平衡，除此功能外，研究還發(fā)現(xiàn)此蛋白在一些特殊情況下還可對(duì)氨、CO2、Cl-、嘧啶、嘌呤、多元醇等具有通透性。到目前為止，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的AQP就有13種，即AQPO～AQP12。AQP單體大小不同，分子量大小在25000～34000之間，每個(gè)AQP分子都包含有6個(gè)疏水的跨膜蛋白和5個(gè)連接環(huán)(A-E)，其一級(jí)結(jié)構(gòu)是由肽鏈的氨基和羧基末端的重復(fù)結(jié)合構(gòu)成，都具有天冬酰胺一脯氨酸一坷氨酸(NPA)特征性序

6、列。AQP在細(xì)胞膜上形成四聚體的立體結(jié)構(gòu)，每個(gè)單體都含有一個(gè)水性孔道。現(xiàn)研究已證明至少有7種AQP(0、1、3、4、8、9、11)的表達(dá)在肝臟細(xì)胞、膽道系統(tǒng)以及膽囊的生理學(xué)作用中起著重要作用。嚙齒類動(dòng)物僅表達(dá)4種AQP(0、8、9、11)，然而在人的肝臟中除了這4種之外還表達(dá)AQP3。在動(dòng)物的肝臟細(xì)胞中，AQP8表達(dá)最為豐富，且擁有多樣的亞細(xì)胞定位，包括滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、線粒體內(nèi)膜、囊泡和小管質(zhì)膜。在肝細(xì)胞中，存在兩類AQP8，一類AQP8

7、穿梭在接近于項(xiàng)質(zhì)膜囊泡和小管質(zhì)膜之間，而這種活動(dòng)是由促膽汁分泌刺激素的控制;另一類是細(xì)胞內(nèi)的AQP8，持久存在于肝細(xì)胞內(nèi)部的線粒體和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上[7-9];而細(xì)胞內(nèi)滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的AQP8可能參與保持在肝組織中糖原合成和分解過(guò)程中細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的滲透濃度。最新研究顯示，線粒體中的AQP8有著兩方面潛在作用:1.吸收NH4+供尿素循環(huán)使用[10];2.在活性氧產(chǎn)生的過(guò)程中從線粒體基質(zhì)中釋放H2O2[11]。
　　目前有關(guān)高血氨對(duì)肝臟造成嚴(yán)重?fù)p

8、傷研究較多，主要有氨中毒學(xué)說(shuō)[12]、血漿氨基酸代謝學(xué)說(shuō)、假神經(jīng)遞質(zhì)學(xué)說(shuō)以及多種毒素相互協(xié)同作用，互為因果，相互依賴，共同促進(jìn)肝性腦病的發(fā)生與發(fā)展，進(jìn)而導(dǎo)致肝衰竭等[13-15];為此，探討并明確致病因素之間的相互作用有很重要研究意義。然而，就氨中毒學(xué)說(shuō)機(jī)制中，關(guān)于氨的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制國(guó)內(nèi)外研究較少，而氨向肝細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)氨的細(xì)胞毒性至關(guān)重要。本研究構(gòu)建氨中毒的細(xì)胞模型，并檢測(cè)氨轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的蛋白R(shí)HCG和AQP8的表達(dá)情況，初步探索氨在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)

9、及毒性機(jī)制，以期能為氨毒性機(jī)制的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)[16]，并為臨床肝衰竭的治療提供理論依據(jù)。
　　目的:
　　檢驗(yàn)氯化銨是否能夠特異性地刺激肝細(xì)胞，使其內(nèi)部與氨離子轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的RHCG和AQP8基因表達(dá)發(fā)生變化。
　　方法:
　　1.培養(yǎng)人正常肝臟細(xì)胞(LO2)、甲狀腺癌細(xì)胞（TPC-1）、卵巢癌細(xì)胞(SKOVR-3)和食管癌細(xì)胞(9706);
　　2.NH4Cl（2.5、5、10、20、40和50mm

10、ol/L）對(duì)4種細(xì)胞作用24h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖;
　　3.熒光定量PCR和蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)LO2細(xì)胞經(jīng)5、10和20mmol/L的NH4Cl處理不同時(shí)間（6、12和24h）后，AQP8和RHCG基因的表達(dá);以及處理不同時(shí)間（12、24和48h）后，AQP8和RHCG蛋白的表達(dá);
　　4.10mmol/L的NH4Cl處理TPC-1、SKOVR-3和9706細(xì)胞不同時(shí)間(6、12和24h)后，AQP8和RHCG基因

11、的表達(dá);以及處理不同時(shí)間（12、24和48h）后，AQP8和RHCG蛋白的表達(dá);
　　結(jié)果:
　　1.隨著NH4Cl濃度的增加，氨對(duì)肝細(xì)胞LO2的增殖抑制率逐漸增加且明顯大于其他細(xì)胞系;
　　2.10mmol/LNH4Cl作用于LO2細(xì)胞6h時(shí)，RHCG基因表達(dá)量明顯下調(diào)(p＜0.05)，而AQP8基因的表達(dá)量在作用12h后較對(duì)照組明顯增加（p＜0.05）;
　　3.10mmol/LNH4Cl作用于LO2細(xì)胞24

12、h時(shí)，AQP8蛋白表達(dá)量較對(duì)照組顯著增加(p＜0.0.5)，而RHCG無(wú)變化;
　　4.相同濃度NH4Cl作用于TPC-1、SKOVR-3和9706細(xì)胞系相同時(shí)間時(shí)，AQP8和RHCG的基因和蛋白水平均未見(jiàn)顯著性變化。
　　結(jié)論:
　　氯化銨能夠特異性地刺激肝細(xì)胞，導(dǎo)致其內(nèi)部與氨離子轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的RHCG和AQP8基因表達(dá)發(fā)生變化，具體如下:
　　1.高氨環(huán)境會(huì)對(duì)肝細(xì)胞造成特異性損傷。
　　2.在氨升高的環(huán)境中