SCAP超表達(dá)對(duì)細(xì)胞脂代謝的影響及其相關(guān)可能機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞內(nèi)膽固醇主要來源有兩種途徑，包括外源性膽固醇攝入和內(nèi)源性膽固醇合成，它們均通過一個(gè)依賴于細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平的反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)的嚴(yán)密控制來保證膽固醇的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡，即主要通過SCAP-SREBP2-LDLr/HMGCoA reductase通路實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)。SREBP2是一個(gè)綁定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜的含三區(qū)域的蛋白。SREBP2的NH2-末端是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，它與一個(gè)多基因編碼酶的啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的膽固醇調(diào)節(jié)元件相結(jié)合，而這一多基因編

2、碼酶在膽固醇合成和膽固醇攝取中起著決定作用。SREBPs的NH2-末端區(qū)域的蛋白水解是相繼進(jìn)行的，蛋白酶裂解SREBPs是由SREBP裂解激活蛋白（SCAP）所激活的。SCAP-SREBP復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)膽固醇下降時(shí)會(huì)產(chǎn)生。SCAP有一個(gè)膽固醇敏感區(qū)域，在細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平增加的時(shí)候，能抑制復(fù)合物的形成，從而形成一個(gè)負(fù)反饋環(huán)。
　　 目的為建立平滑肌特異的固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP）的裂解激活蛋白（SCAP）超表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠，

3、深入探討SCAP的功能，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了由平滑肌特異蛋白SM22啟動(dòng)子（pSM22）啟動(dòng)倉鼠SCAP443位點(diǎn)突變體--SCAP（D443N）的真核表達(dá)質(zhì)粒，并在倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）、腎系膜細(xì)胞（HMCL）、血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）上驗(yàn)證其表達(dá)及功能。
　　 方法1.利用巢式PCR從小鼠肝臟組織提取的基因組中擴(kuò)增得到pSM22基因，利用PCR從pTK-HSV-SCAP（D443N）質(zhì)粒中擴(kuò)增出SCAP（D443N）后構(gòu)建真核表

4、達(dá)質(zhì)粒pcDNA-SM22-SCAP（D443N）。
　　 2.采用兩周齡胎鼠制備原代培養(yǎng)的VSMCs。
　　 3.轉(zhuǎn)染pcDNA-SM22-SCAP（D443N）真核表達(dá)質(zhì)粒分別至CHO細(xì)胞、HMCL細(xì)胞、VSMCs細(xì)胞，驗(yàn)證質(zhì)粒的表達(dá)及功能。用酶學(xué)法分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總膽固醇（TC）水平；油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚情況；提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（real-timequantitative PCR）檢

5、測(cè)LDLr、SREBP2、SCAP、HMGCoA水平；用Western blotting法檢測(cè)LDLr、SREBP2和SCAP、HMGCoA蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果1.成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pTK-HSV-SCAP（D443N）。
　　 2.原代VSMCs制備成功。
　　 3.SCAP過表達(dá)能夠增加細(xì)胞SREBP2、LDLr及HMGCoA的mRNA的表達(dá)及蛋白表達(dá)。即使在高濃度膽固醇水平下，上述基因的合成仍然增