基質(zhì)硬度對(duì)正常人類肝(LO2)細(xì)胞內(nèi)自噬體分布的影響的研究.pdf

1、在各個(gè)器官中，細(xì)胞周?chē)际侨彳浀慕M織，而不是玻璃，塑料那樣硬的表面，但是幾乎所有的關(guān)于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)都是在玻璃，塑料表面進(jìn)行的，然而細(xì)胞外基質(zhì)硬度會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生很大的影響。它能刺激腫瘤的形成，肝癌的形成就是一個(gè)很好地例子，由于肝纖維化和肝硬化使得正常肝組織慢慢變硬從而促進(jìn)了肝癌的發(fā)展。此外，自噬在肝臟疾病中也扮演著重要的角色，研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞系與正常細(xì)胞系相比較而言自噬水平降低了，暗示自噬在腫瘤的中起到抑制的作用，然而在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中細(xì)胞外

2、基質(zhì)硬度是否會(huì)影響自噬還不清楚。
　　因?yàn)長(zhǎng)C3-II的含量與自噬體相關(guān)，而且LC3-II出現(xiàn)在自噬過(guò)程的各個(gè)階段，所以選取LC3作為自噬的標(biāo)記蛋白，但是有研究表明LC3是一種很容易聚集的蛋白，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的暫時(shí)性過(guò)表達(dá)容易引起LC3的聚集，所以構(gòu)建了能穩(wěn)定表達(dá)自噬標(biāo)記蛋白LC3的LO2穩(wěn)定細(xì)胞系是必要的。為了研究基底硬度與自噬的關(guān)系，我們構(gòu)建了能穩(wěn)定表達(dá)自噬標(biāo)記蛋白LC3的LO2穩(wěn)定細(xì)胞系。我們采用一種相比于傳統(tǒng)方法更方便，高效的方

3、法，將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞按照2000/孔，1000/孔，500/孔的比例種到96孔板中篩選15天，成功構(gòu)建了4株穩(wěn)定表達(dá)自噬標(biāo)記蛋白GFP-LC3 LO2單克隆穩(wěn)定細(xì)胞系，選擇其中GFP-LC3表達(dá)量最高的一株進(jìn)行后期的實(shí)驗(yàn)。
　　通過(guò)改變固化劑和聚二甲硅氧烷（PDMS）的比例，我們制備出了11 kPa，124 kPa，1220 kPa三種硬度的PDMS基底，將LO2細(xì)胞培養(yǎng)在這三種硬度的基底和塑料表面（作為對(duì)照）48小時(shí)，接下來(lái)用

4、熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中自噬體的位置，用免疫印跡法分析LC3-II的表達(dá)量，結(jié)果顯示不管是24小時(shí)還是48小時(shí)，LC3-II的表達(dá)量并沒(méi)有顯著地差異，所以我們推斷基質(zhì)硬度對(duì)自噬水平的影響并不大，然而不同硬度的基底卻對(duì)LO2細(xì)胞中自噬體的分布影響很大，更具體些，在軟的基底上（11 kPa PDMS基底）培養(yǎng)48小時(shí)的LO2細(xì)胞中的自噬體在細(xì)胞核周?chē)奂梢粋€(gè)球狀，而硬的基底（1220 kPa PDMS基底）或是塑料基底上的細(xì)胞中的自噬體仍然是