心肌梗死引起的心臟組織學(xué)與細(xì)胞學(xué)改變及其功能研究.pdf

1、背景與目的：
　　急性心肌梗死（AMI）是冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死，是引起充血性心力衰竭的重要原因。心梗后心肌組織發(fā)生凝固性壞死，心肌細(xì)胞腫脹，炎性細(xì)胞浸潤，肌纖維排列紊亂、斷裂，心肌細(xì)胞核固縮、碎裂或溶解消失,梗死區(qū)部分心肌纖維樣變性，部分心肌細(xì)胞肥厚及細(xì)胞核增大。傳統(tǒng)意義認(rèn)為，哺乳動物的心臟是一個終末分化器官，而心肌細(xì)胞是一種終末分化的細(xì)胞，心梗后心肌細(xì)胞沒有再生能力而導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生。近期有研究顯示幼體

2、中存在心肌再生及去分化現(xiàn)象。我們前期研究發(fā)現(xiàn)心梗后小鼠心肌組織肌節(jié)解聚現(xiàn)象明顯，伴隨心肌細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)下降，心梗梗死區(qū)域周邊心肌增殖標(biāo)記物及干細(xì)胞標(biāo)記物則表達(dá)增強(qiáng)，并有部分細(xì)胞同時表達(dá)增殖和心肌的標(biāo)志物。體外研究中將心梗組織培養(yǎng)后，有大量細(xì)胞從組織塊遷移出，除去常規(guī)認(rèn)識中的心肌干細(xì)胞以外，我們發(fā)現(xiàn)有大量較大且為長形或不規(guī)則形狀的細(xì)胞，這些細(xì)胞內(nèi)容物豐富，有類似橫紋的結(jié)構(gòu)存在，同時表達(dá)心肌細(xì)胞及增殖細(xì)胞標(biāo)記物，而假手術(shù)組卻不能獲得這群細(xì)胞

3、。將這群爬出的細(xì)胞與骨髓細(xì)胞共培養(yǎng),可以刺激骨髓細(xì)胞的增殖和分化。本研究的目的是運(yùn)用免疫熒光染色、RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)、蛋白芯片檢測等方法對心梗發(fā)生后小鼠心臟進(jìn)行分析，從而明確其組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)水平在體內(nèi)及體外發(fā)生的改變，初步明確心梗組織遷移出的細(xì)胞群的特性。同時通過條件培養(yǎng)基方式，探討心梗后心肌組織遷移出細(xì)胞的功能。
　　研究方法：
　　在小鼠心臟的左心耳下緣約2 mm處結(jié)扎冠狀動脈左前降支，制備心肌梗死模型,切片后行T

4、TC染色,鑒定心梗區(qū)域。采用免疫熒光染色及統(tǒng)計學(xué)方法，觀察心梗7天后小鼠心臟組織中增殖相關(guān)蛋白ki67及PH3的表達(dá)水平及心肌連接蛋白43（cx-43）和α-橫紋肌肌動蛋白單克隆抗體（α-SA）的表達(dá)水平，探討AMI引起心肌組織結(jié)構(gòu)的變化。采用RT-PCR技術(shù)分析心梗后心肌組織增殖相關(guān)蛋白ki67，PH3，橫紋肌蛋白α-SA，α-actinin及連接蛋白cx-43，轉(zhuǎn)錄因子nkx2.5，肌細(xì)胞增強(qiáng)因子mef2，心肌肌鈣蛋白cTNT，干細(xì)

5、胞標(biāo)記物flk-1的表達(dá)，探討心梗后相對于假手術(shù)小鼠及乳鼠心肌細(xì)胞增殖情況及干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)差異。將心梗小鼠及假手術(shù)對照小鼠心臟組織進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長類型。探討AMI引起心肌細(xì)胞體外的改變。對心梗心肌組織培養(yǎng)后獲得的條件培養(yǎng)基與小鼠骨髓c-kit+細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察心梗后心肌組織遷移出的這群細(xì)胞的功能。并通過蛋白質(zhì)芯片對心梗后心肌組織遷移出細(xì)胞的培養(yǎng)上清進(jìn)行分析，從而對這群細(xì)胞實(shí)施功能的機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　研究結(jié)果：<

6、br>　　在心梗3天后，處死心梗小鼠，取出心臟，切片后行TTC染色，可見心梗區(qū)域被染成白色提示小鼠模型構(gòu)建成功。將心梗組織進(jìn)行免疫熒光染色,發(fā)現(xiàn)心梗后，心梗部位周邊c-kit陽性細(xì)胞增多，ki67和PH3表達(dá)增多，α-SA和cx43表達(dá)減少，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05);同時出現(xiàn)α-SA和ki67雙陽性細(xì)胞及α-SA和PH3雙陽性細(xì)胞增多。心梗組織塊培養(yǎng)后有大量細(xì)胞從組織塊遷移出，包括小且圓亮的細(xì)胞及大且長形或不規(guī)則的細(xì)胞生長，小細(xì)胞提

7、示有心肌干細(xì)胞的大量生長，而大且長形或不規(guī)則的細(xì)胞內(nèi)容物豐富，有類似橫紋的結(jié)構(gòu)存在，通過免疫熒光染色，ki67和α-SA雙染，提示該類細(xì)胞既有心肌細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，又有細(xì)胞增殖現(xiàn)象。PCR分析發(fā)現(xiàn)心梗后小鼠心肌組織相對于假手術(shù)小鼠心肌組織cTnct、α-actinin、nkx2.5、mef2、α-SA、GATA4表達(dá)降低，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05)；ki67、flk-1表達(dá)增高，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05);scl-1沒有明顯差異，無

8、統(tǒng)計學(xué)意義。心梗后小鼠心肌組織相對于乳鼠心肌組織nkx2.5、GATA4、scl-1表達(dá)降低，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05)；α-actinin、mef2、α-SA、flk-1表達(dá)增高，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05)；ki67、cTncT無明顯差異，無統(tǒng)計學(xué)意義。增殖曲線提示心梗心肌組織培養(yǎng)上清相對于假手術(shù)心肌組織培養(yǎng)上清更能夠促進(jìn)c-kit+細(xì)胞增殖。將IMDM、假手術(shù)心肌組織培養(yǎng)上清及心梗心肌組織培養(yǎng)上清與骨髓細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后，IM

9、DM組隨著時間的遷移，Nkx2.5、mef2、GATA4、flk-1、Sca-1、SSEA表達(dá)逐漸減少；假手術(shù)心肌培養(yǎng)上清相對于IMDM組基本能維持這些標(biāo)志物的表達(dá)，心梗組織培養(yǎng)上清的Nkx2.5、mef2、GATA4、flk-1、Sca-1、SSEA的表達(dá)隨著時間的推移表達(dá)逐漸增高，提示心梗心肌組織培養(yǎng)上清能夠刺激骨髓細(xì)胞心肌分化。對心梗心肌組織培養(yǎng)上清和假手術(shù)心肌組織培養(yǎng)上清進(jìn)行蛋白芯片分析，心梗上清CXCL16、IGF-BP-6、

10、IL6、PF-4、sTNF RI、sTNF RII、VEGF、Fg-RIIB、IGF-1、MDC、Pro-MMP-9等生長因子以及一些炎癥相關(guān)的因子的表達(dá)均明顯高于正常上清組，提示心梗心肌組織培養(yǎng)上清刺激骨髓c-kit+干細(xì)胞增殖和心肌分化主要是依靠這些因子的作用。
　　結(jié)論：
　　心梗后小鼠心肌組織肌節(jié)解聚現(xiàn)象明顯，伴隨心肌細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)下降，心梗梗死區(qū)域周邊心肌增殖標(biāo)記物及干細(xì)胞標(biāo)記物則表達(dá)增強(qiáng)，并有部分細(xì)胞同時表達(dá)增殖

11、和心肌的標(biāo)志物。心梗小鼠心肌組織培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)除去常規(guī)認(rèn)識中的心肌干細(xì)胞以外，我們發(fā)現(xiàn)有大量較大且為長形或不規(guī)則形狀的細(xì)胞，這些細(xì)胞內(nèi)容物豐富，有類似橫紋的結(jié)構(gòu)存在，同時表達(dá)心肌細(xì)胞及增殖細(xì)胞標(biāo)記物。而假手術(shù)小鼠心肌組織中只有成纖維類細(xì)胞爬出。因此我們推論這類細(xì)胞為假定的去分化的心肌細(xì)胞。用心梗心肌組織培養(yǎng)上清與骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)，我們發(fā)現(xiàn)心梗的上清更能夠刺激骨髓細(xì)胞的增殖。心梗心肌組織培養(yǎng)上清中含有較假手術(shù)上清更高的生長因子包括IGF-1、