曲美他嗪通過mTORC2-SGK1通路對脂多糖所致急性肺損傷的治療作用及其機制的研究.pdf

1、研究背景：
　　急性肺損傷(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome)是以肺內(nèi)彌漫性炎細胞浸潤、肺組織循環(huán)障礙、肺毛細血管通透性增加及低氧血癥為特點的臨床綜合征，目前是呼吸與危重癥醫(yī)學研究的重點、難點，預后極差，病情兇險，可迅速進展為多器官功能不全，為此防治本類疾病對臨床有重要意義。目前國內(nèi)外已經(jīng)進行了一系列的基礎與臨床實驗研究，但未闡

2、明ALI/ARDS的發(fā)病機制。如果能有效地清除肺泡腔內(nèi)過多的水腫液，對維持患者氣體交換和改善氧合指數(shù)非常重要，同時可降低此類患者的病死率和死亡率。肺泡上皮鈉通道(epithelial sodium channel, ENaC)是肺泡腔內(nèi)鈉水轉運和推動水腫液清除的重要環(huán)節(jié)，是完成肺泡腔內(nèi)鈉離子跨膜轉運的限速步驟和提供肺泡清除(alveolar fluid clearance, AFC)的源動力，亦協(xié)同鈉/鉀ATP酶共同完成鈉水轉運過程，在

3、肺泡清除中發(fā)揮重要的作用。
　　初始有關 ALI/ARDS的研究主要集中在炎癥假說方面，比如糖皮質激素、自由基清除劑、抗氧化劑及肺泡表面活性物質等，并涉及如下機制調(diào)控（如圖-2所示），通過支持、抗炎及輔助通氣等綜合治療后仍存在療效不滿意或產(chǎn)生不良反應。因此，解決某一方面的問題很難對疾病的治療起到根本性作用。
　　治療ALI/ARDS的關鍵步驟是把過多的水腫液排除到肺泡腔外，來推動肺水清除，這對維持氣體交換和恢復氧合指標具有重

4、要的指導意義。肺泡上皮細胞本身具有清除過多液體的能力，脂多糖內(nèi)毒素誘發(fā)的損傷是引起ALI/ARDS水腫液聚集的重要因素。本研究擬通過SGK1途徑在保護肺泡上皮細胞的同時可增強肺泡水腫液清除(AFC)，對臨床治療ALI/ARDS具有重要的意義，為探索ENaC在AFC的作用機制更具有一定的臨床實用價值，亦為尋找一種有效調(diào)控ENaC及上游信號通路的藥物提供新的治療靶點。
　　mTOR是絲氨酸-蘇氨酸的高度保守序列，在細胞生長、代謝及存活

5、過程中發(fā)揮核心控制作用[12]。根據(jù)mTOR結構、功能以及對雷帕霉素敏感性的不同可分為mTOR復合物1（mTORC1）和mTOR復合物2（mTORC2）兩條不同的信號通路。其中mTORC2屬于PIKK家族成員，在調(diào)節(jié)鈉離子轉運、蛋白翻譯等過程中起重要的調(diào)節(jié)作用[13]。同時亦是來自上游的細胞內(nèi)外信號向下游轉導的感應器[20]，對 ENaC具有正調(diào)節(jié)功能。
　　曲美他嗪是一種心肌保護藥，在心臟中的研究甚多[8]，是通過其抑制脂肪酸β

6、氧化[9]，促進葡萄糖有氧氧化[10]，來降低產(chǎn)生ATP所需的氧耗及產(chǎn)生高能鍵，亦具有清除自由基、穩(wěn)定細胞膜的作用。研究發(fā)現(xiàn)此藥在急性胰腺炎中能炎性介質IL-1a、IL-6及TNF-a水平明顯降低，有利于保護胰腺組織[21]。其作用機制是通過活化細胞膜表面的ATP酶，抑制氧化應激（ROS）及影響 mTORC通路來發(fā)揮藥理學作用。此藥在急性肺損傷中的相關研究尚未見報道，本課題擬用曲美他嗪干預mTORC2/SGK1信號通路來觀察對LPS所致

7、急性肺損傷的療效，為臨床治療ALI/ARDS提供一種新的治療途徑。
　　目的：
　　從體內(nèi)和體外實驗兩個層面研究曲美他嗪干預ALI/ARDS模型，觀察其能否調(diào)控mTORC2/SGK1信號通路及對ENaC作用的分子機理，為ALI/ARDS發(fā)病機制的研究提供基礎和對治療提供新思路。
　　方法：
　　本實驗由三部分組成
　　1.第一部分：從體外實驗探討 mTORC2/SGK1信號通路對 ENaC的影響
　　

8、通過體外細胞培養(yǎng)實驗來檢測mTORC2/SGK1信號通路對ENaC活性的影響；采用ELISA檢測炎性因子和WB、免疫熒光等方法說明該通路對ENaC各亞基的表達。
　　2.第二部分：通過體內(nèi)實驗檢測mTORC2/SGK1信號通路對ENaC活性的影響，來觀察該通路對ENaC各亞基的表達。
　　通過體內(nèi)實驗檢測mTORC2/SGK1信號通路對ENaC活性的影響；采用ELISA、WB、免疫組化及干/濕重等手段檢測該通路對ENaC的表

9、達。
　　3．第三部分：曲美他嗪對 LPS所致肺損傷中 mTORC2/SGK1信號通路保護機制的相關研究
　　通過曲美他嗪干預LPS所致急性肺損傷中mTORC2/SGK1信號通路及觀察對 ENaC各亞基的表達，為臨床治療該病提供一種新的思路和方法。
　　結果：
　　1.從體外實驗探討 mTORC2/SGK1信號通路對 ENaC各亞基的表達
　　我們利用促炎介質 IL-6,IL-8和 TNF-α作為急性肺損傷

10、/急性呼吸窘迫綜合征惡化的炎性調(diào)節(jié)器。收集細胞上清液通過 ELISA法測定IL-6、IL-8及TNF-α。我們發(fā)現(xiàn)在體外建立的ALI模型中IL-6、IL-8和TNF-α分泌均是增加的。
　　2.從體內(nèi)實驗探討mTORC2/SGK1信號通路對ENaC的影響
　　由于ENaC在 mTORC2/SGK1信號通路的下游,據(jù)報道m(xù)TOR在ALI/ARDS中起重要的作用[1-3]。這個證據(jù)促使我們假設mTORC2/SGK1信號通路能調(diào)節(jié)

11、ENaC。我們采用 W-B測定 mTOR和SGK1蛋白水平來驗證這個假設是成立的。結果表明：mTORC2/SGK1信號通路能調(diào)節(jié)ENaC的各亞基。
　　3.曲美他嗪對LPS所致肺損傷中mTORC2/SGK1信號通路保護機制的相關研究
　　在脂多糖誘導組等離子體膜中ENAC各亞基的表達降低，經(jīng)曲美他嗪治療后各亞基恢復正常；炎性因子的分泌明顯減少，表明曲美他嗪不僅能減輕炎癥反應，而且通過增加ENAC各亞基的表達來提高Na+轉運，

12、進而減輕肺水腫；在脂多糖誘導細胞組曲美他嗪能上調(diào)mTOR,并通過其增加SGK1的表達,表明此藥能調(diào)節(jié)mTORC2/SGK1通路；脂多糖治療的小鼠干/濕重比是顯著增加的,然而,通過曲美他嗪治療后其比值降低(與藥物濃度呈正比)。
　　結論：
　　1.從體內(nèi)外急性肺損傷模型中曲美他嗪能減輕肺損傷和肺水腫,故為此病的治療提供一個新的治療途徑。
　　2.在脂多糖誘導的細胞、動物模型中，曲美他嗪能通過減少促炎細胞因子的分泌來減輕急