睪酮對(duì)原代海馬神經(jīng)元突觸可塑性的快速影響以及ERK-MAPK和CREB信號(hào)通路相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、雄激素是主要由睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成分泌的類固醇激素，其生理作用是影響胚胎的發(fā)育、維持生精功能、刺激生殖器官生長(zhǎng)發(fā)育、促進(jìn)男性第二性征出現(xiàn)、維持性欲等。除此之外，腦內(nèi)的海馬組織也能自身合成雄激素，而且腦內(nèi)雄激素的水平高于循環(huán)血液中雄激素的水平，由此許多學(xué)者關(guān)注到雄激素的神經(jīng)保護(hù)作用。目前大量研究表明，雄激素的腦保護(hù)作用主要體現(xiàn)在以下幾方面：調(diào)節(jié)腦的發(fā)育、性別二態(tài)性、學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知功能以及情緒，增強(qiáng)細(xì)胞活力，對(duì)抗氧化應(yīng)激、血清剝奪，或者Aβ等造

2、成的損害等等。本實(shí)驗(yàn)著重研究雄激素對(duì)突觸可塑性的調(diào)節(jié)作用。
　　流行病學(xué)資料也表明，隨著年齡增長(zhǎng)，雄激素水平降低，相應(yīng)的腦的學(xué)習(xí)認(rèn)知能力會(huì)逐漸減退。故而，認(rèn)為年齡相關(guān)的雄激素水平減低是老年男性發(fā)生阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。我們的之前的研究也已經(jīng)證明，去勢(shì)引起的雄激素水平下降可以影響SAMP8小鼠海馬的突觸可塑性，損害學(xué)習(xí)記憶的能力，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。雄激素補(bǔ)充治療則可以逆轉(zhuǎn)這些

3、改變。因此，研究一定劑量的雄激素能否維持突觸可塑性的正常，將對(duì)于深入理解年齡相關(guān)的雄激素水平減低導(dǎo)致AD發(fā)生具有十分重要的意義。
　　像其它甾體類激素一樣，雄激素發(fā)揮其生理功能有兩條途徑。一是經(jīng)典的基因組途徑。甾體類激素自由穿過細(xì)胞膜，到達(dá)胞質(zhì)，特異性的激活并結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)的類固醇受體蛋白質(zhì)，結(jié)合激素的類固醇受體以二聚體或異二聚體的形式再與位于靶基因啟動(dòng)子上特異的DNA反應(yīng)元件作用，從而激活或抑制轉(zhuǎn)錄過程以及后續(xù)的蛋白質(zhì)合成。二是快

4、速的非經(jīng)典途徑。非基因組機(jī)制至少應(yīng)該具備以下特征之一：（1）作用速度較快，常在數(shù)秒鐘或數(shù)分鐘內(nèi)完成；（2）胞膜介導(dǎo)；（3）不被經(jīng)典的雄激素受體拮抗劑氟他胺所阻斷（除非拮抗劑具有的結(jié)構(gòu)與雄激素胞膜結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)，是雄激素基因組和非基因組受體共同的部分）；（4）無(wú)直接轉(zhuǎn)錄/翻譯機(jī)制的激活，即使在有DNA轉(zhuǎn)錄抑制劑和蛋白質(zhì)合成抑制劑存在的情況下，也能發(fā)揮作用。已有研究表明，雄激素可以通過快速的非基因組途徑調(diào)節(jié)突觸的結(jié)構(gòu)可塑性。我們前期的研究也證

5、明，海馬神經(jīng)元的胞膜上存在著雄激素特異性的結(jié)合位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使用不透過細(xì)胞膜的睪酮-牛血清白蛋白大分子復(fù)合物作用于原代海馬神經(jīng)元，觀察其對(duì)突觸引起的一系列變化，以證實(shí)這些影響是通過細(xì)胞膜受體介導(dǎo)而完成的。另外觀察經(jīng)典的雄激素核受體拮抗劑氟他胺能否阻斷由睪酮引發(fā)的海馬神經(jīng)元突觸的一系列改變。
　　之前關(guān)于適時(shí)適量雄激素促進(jìn)樹突棘生長(zhǎng)的研究多是整體和組織水平的，而鮮有細(xì)胞層面上的實(shí)驗(yàn)報(bào)道。本課題采用原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元為研究對(duì)象，觀

6、察睪酮在短時(shí)間（1 h）內(nèi)引起的神經(jīng)元樹突棘密度的變化。與動(dòng)物模型相比，體外培養(yǎng)的原代神經(jīng)元具有影響因素單一、機(jī)體干擾因素少和實(shí)驗(yàn)條件易控制等優(yōu)點(diǎn)。而且，原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元的發(fā)育階段、相互作用、形態(tài)特征以及各種突觸蛋白的表達(dá)模式和定位等生物學(xué)特征與在體神經(jīng)元基本相同，在一定程度上能夠代表在體神經(jīng)元的生理和病理狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)從觀察對(duì)象上進(jìn)一步完善了雄激素快速調(diào)節(jié)樹突棘生長(zhǎng)的理論體系，對(duì)深入理解雄激素發(fā)揮生理作用的方式有一定的幫助。

7、　　突觸相關(guān)蛋白在維持突觸正常的功能中發(fā)揮著重要的作用。突觸前終末的活性區(qū)聚集了充滿神經(jīng)遞質(zhì)的突觸囊泡。在神經(jīng)遞質(zhì)釋放的過程中，突觸囊泡的活動(dòng)受到突觸前蛋白及其復(fù)合體相互作用的調(diào)節(jié)。突觸素（synaptophysin，SYN）是一種位于突觸囊泡膜上的整合蛋白，在中樞神經(jīng)、周圍神經(jīng)以及神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞上均有廣泛表達(dá)，也是胞質(zhì)內(nèi)Ca2+在突觸囊泡上的結(jié)合位點(diǎn)，參與突觸囊泡膜與突觸前膜的融合和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，為突觸終末特異性標(biāo)記物。其分布數(shù)量和

8、密度可間接反映突觸的數(shù)量和密度，是突觸可塑性一個(gè)重要的參考指標(biāo)。
　　興奮性突觸的突觸后膜，在電鏡下呈現(xiàn)一增厚的突觸后致密帶（postsynaptic density，PSD），是由神經(jīng)遞質(zhì)受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和細(xì)胞骨架蛋白等組成的復(fù)合物。具有一系列的突觸相關(guān)功能，比如調(diào)控離子通道、活化突觸和參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。PSD95是PSD中含量最豐富的蛋白之一，其負(fù)責(zé)的裝配和組織作用在突觸后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中居于核心位置。它還與N-甲基-D-

9、天門冬氨酸受體的調(diào)節(jié)亞基及其相關(guān)的信號(hào)蛋白相作用，參與信息的存儲(chǔ)過程。目前 PSD95已被廣泛用作突觸后特異性標(biāo)志物，是突觸可塑性的另一重要指標(biāo)。
　　N-甲基-D-天門冬氨酸（N-Methyl-D-Aspartate，NMDA）受體是一種谷氨酸能的鈣離子電壓門控通道，能夠選擇性的被NMDA或谷氨酸激活,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的功能是調(diào)節(jié)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞。因此NMDA受體與學(xué)習(xí)、記憶等活動(dòng)密切相關(guān)。NMDA受體存在多個(gè)亞基。其中NR

10、1亞基對(duì)功能性GluN通道的聚集有重要作用，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，為功能性的NMDA受體所必需，是該受體的基本單位。
　　雖然雄激素影響突觸可塑性，突觸可塑性的調(diào)節(jié)與突觸標(biāo)志性蛋白也密不可分，但是關(guān)于雄激素快速調(diào)節(jié)突觸相關(guān)蛋白表達(dá)的報(bào)道尚不多見。我們之前的研究表明，雄激素（睪酮和雙氫睪酮）能夠通過非基因組效應(yīng)上調(diào)老年去勢(shì)SAMP8小鼠海馬神經(jīng)元突觸蛋白SNAP25、Syt1、SYN、PSD95、NR1和 Drebrin的蛋白表達(dá)

11、，從而影響海馬神經(jīng)元的突觸可塑性；雙氫睪酮也可以上調(diào)MCI期SAMP8去勢(shì)小鼠海馬神經(jīng)元突觸蛋白SYN、PSD95和Drebrin的表達(dá)；本研究將進(jìn)一步探討睪酮能否引起原代海馬神經(jīng)元突觸蛋白SYN、PSD95和NR1的蛋白和mRNA表達(dá)水平快速變化。
　　雖然諸多學(xué)者致力于睪酮對(duì)突觸可塑性的快速作用研究，但是其作用機(jī)制至今仍未完全明了。突觸可塑性受到多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)，目前發(fā)現(xiàn)的雄激素作用相關(guān)的信號(hào)通路有ERK/MAPK、PKA、P

12、KC、p38/ MAPK、LIMK以及CaMKⅡ等。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）及其下游的轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）在睪酮介導(dǎo)的神經(jīng)元突觸可塑性中發(fā)揮的作用。
　　大量事實(shí)證明，興奮性的谷氨酸能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程需要激活 ERK。在諸如學(xué)習(xí)和記憶等多種形式

13、的神經(jīng)系統(tǒng)高級(jí)活動(dòng)中，該過程參與調(diào)控神經(jīng)元的突觸可塑性，包括功能可塑性（比如長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)LTP）和結(jié)構(gòu)可塑性（比如樹突棘的生長(zhǎng)）。有關(guān) CREB的研究起步很早，從無(wú)脊椎動(dòng)物到嚙齒類動(dòng)物的研究都表明，CREB依賴的轉(zhuǎn)錄對(duì)多種形式的學(xué)習(xí)和記憶都十分重要。CREB的第133位絲氨酸磷酸化將引起其它經(jīng)由cAMP反應(yīng)元件（cAMP response element，CRE）的轉(zhuǎn)錄機(jī)制來(lái)共同調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，因此推測(cè) CREB第133位絲氨酸磷酸化是引起

14、學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因表達(dá)至關(guān)重要的一步。我們之前對(duì) MCI期 SAMP8去勢(shì)小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，雙氫睪酮會(huì)上調(diào)小鼠海馬神經(jīng)元 ERK和 CREB的磷酸化水平。據(jù)此我們推測(cè)ERK/MAPK和CREB信號(hào)通路有可能參與介導(dǎo)雄激素對(duì)突觸結(jié)構(gòu)可塑性的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步探討ERK/MAPK和CREB信號(hào)通路是否在睪酮引起的原代海馬神經(jīng)元樹突棘生長(zhǎng)中發(fā)揮作用。
　　綜上所述，本課題以原代海馬神經(jīng)元為研究對(duì)象，考察雄激素通過上調(diào)樹突棘密度影響突觸結(jié)構(gòu)

15、可塑性的作用；揭示雄激素對(duì)于原代海馬神經(jīng)元突觸標(biāo)志性蛋白SYN、PSD95和NR1的蛋白和mRNA表達(dá)水平的快速影響；并進(jìn)一步研究雄激素快速調(diào)節(jié)突觸結(jié)構(gòu)可塑性的分子機(jī)制，探討ERK/MAPK和CREB信號(hào)通路是否參與其中。
　　第一部分睪酮對(duì)原代海馬神經(jīng)元樹突棘密度的快速調(diào)節(jié)作用
　　目的：本課題采用體外培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元為研究對(duì)象，旨在考察睪酮在短時(shí)間內(nèi)對(duì)樹突棘密度的快速調(diào)節(jié)作用。并利用睪酮-牛血清白蛋白（Testost

16、erone-Bovine serum albumin，T-BSA）不能穿透細(xì)胞膜的特點(diǎn)，進(jìn)一步證明睪酮快速影響神經(jīng)元結(jié)構(gòu)可塑性的功能是通過膜受體介導(dǎo)的非經(jīng)典途徑實(shí)現(xiàn)的；考察經(jīng)典的雄激素核受體抑制劑氟他胺（Flutamide， Flu）能否阻斷雄激素膜受體介導(dǎo)的樹突棘上調(diào)作用，以探討雄激素膜受體和核受體之間有無(wú)特異性差別。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)一原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)和鑒定
　　取17或18天的SD孕鼠，麻醉后取出胎鼠，斷

17、頭取腦，剝離海馬，組織破碎后于 Accutase中消化，玻璃吸管吹打，種植細(xì)胞懸液。海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)18天備用。以抗MAP2的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色方法，對(duì)原代海馬神經(jīng)元進(jìn)行純度鑒定。MAP2對(duì)神經(jīng)元的胞體和突起著色， Hoechst33258對(duì)細(xì)胞核染色，根據(jù)公式MAP2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/Hoechst33258陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)×100％，計(jì)算神經(jīng)元的細(xì)胞純度。
　　實(shí)驗(yàn)二睪酮快速影響原代海馬神經(jīng)元樹突棘密度的時(shí)效實(shí)驗(yàn)
　　選用體外培

18、養(yǎng)18天的原代海馬神經(jīng)元，隨機(jī)分為對(duì)照組（0 min組）、15 min處理組（15 min組）、30 min處理組（30 min組）、1 h處理組（1 h組）和2 h處理組（2 h組）。時(shí)效實(shí)驗(yàn)加入睪酮時(shí)間分別為15 min，30 min，1 h和2 h。根據(jù)參考文獻(xiàn)，施加睪酮的濃度為10 nM，對(duì)照組給予等量 DMSO處理。作用完畢后，對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行大腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白（Developmentally regulated brain pro

19、tein，Drebrin）的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色，觀察睪酮作用不同時(shí)間樹突棘密度的變化。600×光鏡下計(jì)數(shù)原代海馬神經(jīng)元胞體50μm以外、每20μm樹突上棘的數(shù)目，計(jì)算平均每μm樹突上棘的數(shù)目作為樹突棘密度。
　　實(shí)驗(yàn)三睪酮快速影響原代海馬神經(jīng)元樹突棘密度的量效實(shí)驗(yàn)
　　實(shí)驗(yàn)選用體外培養(yǎng)18天的原代海馬神經(jīng)元，根據(jù)參考文獻(xiàn)以及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照加入睪酮的濃度隨機(jī)分為1 nM組（1 nM組）、10 nM（10 nM組）、100

20、nM（100 nM組）、1000 nM（1000 nM組）。睪酮作用時(shí)間選定為時(shí)效實(shí)驗(yàn)中雄激素對(duì)樹突棘密度影響最為顯著的1h。之后對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行抗Drebrin的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色，觀察神經(jīng)元在不同劑量的睪酮作用下樹突棘密度的變化。
　　實(shí)驗(yàn)四睪酮快速影響原代海馬神經(jīng)元樹突棘密度的實(shí)驗(yàn)
　　實(shí)驗(yàn)選用體外培養(yǎng)18天的原代海馬神經(jīng)元，隨機(jī)分為對(duì)照組（Con組）、睪酮組（T組）、睪酮-牛血清白蛋白組（T-BSA組）、氟他胺+睪酮組

21、（F+T組）。依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定雄激素對(duì)樹突棘密度影響最為顯著的時(shí)間和劑量分別為1 h和10 nM。氟他胺于睪酮加入前預(yù)先作用1 h?？笵rebrin的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色標(biāo)記神經(jīng)元的樹突棘，觀察10 nM的睪酮作用1h后樹突棘密度的變化。
　　結(jié)果：
　　1原代海馬神經(jīng)元純度鑒定
　　用神經(jīng)元特異性標(biāo)記物MAP2抗體標(biāo)記神經(jīng)元，二抗采用Dylight594標(biāo)記為紅光，Hoechst33258復(fù)染標(biāo)記全部細(xì)胞胞核。

22、MAP2陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿、軸突和樹突均呈紅色，胞核不著色，Hoechst33258標(biāo)記胞核呈藍(lán)色。神經(jīng)元純度為MAP2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占Hoechst33258標(biāo)記總細(xì)胞核數(shù)的比值，結(jié)果顯示原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞純度>90％。
　　2睪酮快速影響原代海馬神經(jīng)元樹突棘密度的時(shí)效實(shí)驗(yàn)
　　用抗Drebrin的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色來(lái)顯示原代海馬神經(jīng)元的樹突棘，可見在給予睪酮處理的2h內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組樹突棘的密度均有不同程度的增加。以給藥1 h組樹

23、突棘的密度2.08±0.15 thorns/μm為最大，較對(duì)照組1.3±0.15 thorns/μm明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。給藥2 h組，樹突棘密度為1.75±0.15 thorns/μm，與1 h組相比減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。多重比較分析組間數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3睪酮快速影響原代海馬神經(jīng)元樹突棘密度的量效實(shí)驗(yàn)
　　不同劑量的睪酮作用于原代海馬神經(jīng)元，

24、樹突棘密度分別為1 nM組1.54±0.16 thorns/μm、10 nM組2.15±0.14 thorns/μm、100 nM組1.92±0.18 thorns/μm、1000 nM組1.39±0.18 thorns/μm。以10 nM組神經(jīng)元的樹突棘密度為最大，較其它三組均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其次是100 nM組，較1 nM組和1000 nM組均有明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　4睪

25、酮快速影響原代海馬神經(jīng)元樹突棘密度的實(shí)驗(yàn)
　　與Con組（1.12±0.10）相比，T組（1.96±0.19）、T-BSA組（1.90±0.18）和F+T組（1.34±0.14）的樹突棘密度均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；F+T組樹突棘密度較T組和T-BSA組減低，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；T組和T-BSA組相比，無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1給予不同劑量的睪酮，對(duì)原代海馬神經(jīng)

26、元作用不同時(shí)間，都可以引起樹突棘密度的增高。以10 nM的睪酮處理1 h引起樹突棘密度增加的作用最為顯著。
　　2睪酮可以在短時(shí)間內(nèi)上調(diào)樹突棘密度，該作用主要通過非經(jīng)典的膜受體介導(dǎo)而完成。
　　3經(jīng)典的雄激素核受體抑制劑氟他胺不能完全阻斷睪酮對(duì)樹突棘生長(zhǎng)的快速調(diào)節(jié)作用，原代海馬神經(jīng)元胞膜上的雄激素結(jié)合位點(diǎn)與經(jīng)典的核受體存在一定的差異。
　　第二部分睪酮對(duì)原代海馬神經(jīng)元突觸蛋白表達(dá)的快速影響
　　目的：采用體外培養(yǎng)

27、的原代海馬神經(jīng)元為研究對(duì)象，檢測(cè)睪酮對(duì)海馬神經(jīng)元突觸標(biāo)志性蛋白SYN、PSD95和NR1蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)的快速影響。探索雄激素的快速作用與突觸標(biāo)志性蛋白表達(dá)之間的關(guān)系，有助于理解雄激素發(fā)揮生理作用的方式。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)一免疫熒光細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)突觸標(biāo)志性蛋白SYN、PSD95和NR1的蛋白表達(dá)
　　實(shí)驗(yàn)選用體外培養(yǎng)18天的原代海馬神經(jīng)元，隨機(jī)分為對(duì)照組（Con組）、睪酮組（T組）、睪酮-牛血清白蛋白組（T

28、-BSA組）和氟他胺+睪酮組（F+T）。根據(jù)第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定T組、T-BSA組給藥濃度分別為10 nM、0.36 nM，作用時(shí)間為1 h；氟他胺預(yù)處理時(shí)間為1 h。之后行抗SYN、PSD95和NR1的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色。采集圖像，計(jì)算平均熒光強(qiáng)度，分析在睪酮快速作用下，這些突觸標(biāo)志性蛋白表達(dá)的變化。
　　實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)突觸標(biāo)志性蛋白 SYN、PSD95和NR1的蛋白表達(dá)
　　實(shí)驗(yàn)對(duì)象、實(shí)驗(yàn)分組和給藥方式同

29、實(shí)驗(yàn)一。海馬神經(jīng)元經(jīng)藥物干預(yù)后提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)。Odyssey紅外成像系統(tǒng)顯影成像，以GAPDH的表達(dá)做為內(nèi)參，測(cè)定各組突觸蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。
　　實(shí)驗(yàn)三實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法檢測(cè)突觸標(biāo)志性蛋白 SYN、PSD95和NR1的mRNA表達(dá)
　　實(shí)驗(yàn)對(duì)象、實(shí)驗(yàn)分組和給藥方式同實(shí)驗(yàn)一。海馬神經(jīng)元經(jīng)藥物干預(yù)后提取細(xì)胞 mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈，之后實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Quantitative real-t

30、ime PCR，q-PCR）方法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組突觸標(biāo)志性蛋白SYN、PSD95和NR1在睪酮作用下mRNA表達(dá)水平的快速變化。
　　結(jié)果：
　　1免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)SYN、PSD95和NR1的蛋白表達(dá)
　　SYN的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與Con組（0.064±0.003）相比，T組（0.089±0.004）、T-BSA組（0.085±0.004）和F+T組（0.070±0.004）的平均熒光強(qiáng)度均明顯增加，

31、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；F+T組的熒光強(qiáng)度較T組和T-BSA組減低，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；T組和T-BSA組相比，無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　PSD95的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與Con組（0.047±0.004）相比，T組（0.074±0.004）、T-BSA組（0.070±0.004）和F+T組（0.070±0.005）的平均熒光強(qiáng)度明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；而T組、T-

32、BSA組和F+T組之間，任兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　NR1的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與Con組（0.031±0.004）相比，T組（0.074±0.004）、T-BSA組（0.074±0.003）和F+T組（0.044±0.003）的平均熒光強(qiáng)度明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；F+T組的熒光強(qiáng)度較T組和T-BSA組減低，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；T組和T-BSA組相比，無(wú)明顯差異

33、（P>0.05）。
　　2蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)SYN，PSD95和NR1的蛋白表達(dá)
　　SYN的免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與 Con組（1.478±0.074）相比，T組（2.787±0.153）、T-BSA組（2.629±0.155）和F+T組（2.164±0.144）條帶相對(duì)于內(nèi)參GAPDH的光密度值明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；F+T組的光密度值較T組和T-BSA組減低，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；T

34、組和T-BSA組相比，無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　PSD95的免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與Con組（0.276±0.017）相比， T組（0.460±0.035）、T-BSA組（0.463±0.015）和F+T組（0.427±0.025）條帶相對(duì)于內(nèi)參GAPDH的光密度值明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；而T組、T-BSA組和F+T組之間，任兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　NR1的免疫印跡實(shí)驗(yàn)

35、結(jié)果顯示：與 Con組（0.031±0.004）相比，T組（0.069±0.003）、T-BSA組（0.070±0.004）和F+T組（0.037±0.003）條帶相對(duì)于內(nèi)參GAPDH的光密度值明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；F+T組的光密度值較T組和T-BSA組減低，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；T組和T-BSA組相比，無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　3 q-PCR技術(shù)檢測(cè)SYN，PSD95和NR1的mRNA

36、表達(dá)
　　SYN的q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與Con組相比，T組（28.22±3.57）、T-BSA組（32.57±3.62）和F+T組（11.63±0.29）的mRNA表達(dá)水平均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；F+T組的mRNA表達(dá)較T組和T-BSA組減低，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；T組和T-BSA組相比，無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　PSD95的q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與Con組相比，T組（5.9

37、4±0.22）、T-BSA組（5.85±0.21）和F+T組（5.40±0.08）的mRNA表達(dá)水平明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；而T組、T-BSA組和F+T組之間，任兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　NR1的q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與Con組相比，T組（20.64±0.45）、T-BSA組（20.04±0.62）和F+T組（3.21±0.10）的mRNA表達(dá)水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0

38、1）；F+T組的mRNA表達(dá)較T組和T-BSA組減低，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；T組和T-BSA組相比，無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1睪酮及睪酮-牛血清白蛋白能快速上調(diào)原代海馬神經(jīng)元突觸標(biāo)志性蛋白SYN、PSD95和NR1的蛋白和mRNA表達(dá)。
　　2氟他胺預(yù)處理部分阻斷了睪酮引起的突觸蛋白SYN和NR1的蛋白及mRNA表達(dá)增加，未能抑制睪酮引起的PSD95的蛋白和mRNA表達(dá)上調(diào)。

39、　　3睪酮對(duì)原代海馬神經(jīng)元突觸標(biāo)志物 SYN、PSD95和 NR1蛋白和mRNA表達(dá)的上調(diào)作用主要通過非基因組途徑實(shí)現(xiàn)。
　　第三部分 ERK/MAPK和CREB信號(hào)通路參與睪酮對(duì)原代海馬神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)可塑性的調(diào)節(jié)作用
　　目的：以原代海馬神經(jīng)元為研究對(duì)象，觀察睪酮對(duì)神經(jīng)元ERK/MAPK和 CREB磷酸化水平的快速影響；為證明該信號(hào)通路的特異性，對(duì)原代海馬神經(jīng)元給予 U0126預(yù)處理，觀察其是否特異性的阻斷由睪酮引起的ER

40、K/MAPK和CREB磷酸化，以及由睪酮引起的神經(jīng)元樹突棘密度增加。本課題旨在進(jìn)一步探討睪酮影響原代海馬神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)可塑性的分子機(jī)制。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)一睪酮對(duì)原代海馬神經(jīng)元ERK/MAPK和CREB磷酸化水平的影響
　　實(shí)驗(yàn)選用體外培養(yǎng)18天的原代海馬神經(jīng)元，隨機(jī)分為對(duì)照組（Con組）、睪酮組（T組）、睪酮-牛血清白蛋白組（T-BSA組）和氟他胺+睪酮組（F+T）。T、T-BSA和F的給藥方法和劑量與第二部分相

41、同。提取神經(jīng)元的蛋白， BCA方法進(jìn)行蛋白定量，以液相蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)ERK1/2/MAPK和CREB的磷酸化水平。
　　實(shí)驗(yàn)二 U0126預(yù)處理后睪酮對(duì)ERK/MAPK和CREB磷酸化的影響
　　實(shí)驗(yàn)分組同實(shí)驗(yàn)一。T、T-BSA和F的給藥方法同第一、二部分。體外培養(yǎng)18天的原代海馬神經(jīng)元，給予睪酮之前，先用U0126處理1 h，之后采用蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測(cè) ERK1/2/MAPK和 CREB的磷酸化水平。
　　實(shí)驗(yàn)

42、三 U0126預(yù)處理后睪酮對(duì)樹突棘密度的影響
　　實(shí)驗(yàn)分組和給藥方法同實(shí)驗(yàn)二?？笵rebrin免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色方法觀察原代海馬神經(jīng)元樹突棘密度，探討 U0126在睪酮上調(diào)樹突棘密度過程中的抑制作用。
　　結(jié)果：
　　1睪酮對(duì)原代海馬神經(jīng)元ERK/MAPK和CREB的快速活化作用
　　ERK1/2/MAPK的液相蛋白芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與 Con組（0.069±0.007）相比，T組（0.357±0.026）、T

43、-BSA組（0.364±0.050）和F+T組（0.178±0.031）的磷酸化水平均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；F+T組的磷酸化水平較T組和T-BSA組減低，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；T組和T-BSA組相比無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　CREB的液相蛋白芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與Con組（0.243±0.045）相比，T組（0.862±0.121）、T-BSA組（0.890±0.086）和F+T組（0.5

44、51±0.017）的磷酸化水平均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；F+T組的磷酸化水平較T組和T-BSA組減低，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；T組和T-BSA組相比，無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　液相蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)到各實(shí)驗(yàn)組中，ERK/MAPK和CREB的總蛋白水平無(wú)變化（P>0.05）。
　　2 U0126抑制了睪酮引起的ERK1/2/MAPK和CREB活化
　　原代海馬神經(jīng)元經(jīng)U0126處理1

45、 h后，給予睪酮和睪酮-牛血清白蛋白作用，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)ERK1/MAPK和ERK2/MAPK的磷酸化水平。結(jié)果如下，Con組：0.345±0.054、0.034±0.002；T組：0.288±0.029、0.035±0.002；T-BSA組：0.350±0.014、0.036±0.003；F+T組：0.403±0.038、0.032±0.002。ERK1和ERK2的磷酸化水平在各組之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

46、
　　免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè) CREB的磷酸化水平。結(jié)果顯示：Con組，0.168±0.007；T組，0.161±0.007；T-BSA組，0.178±0.001；F+T組，0.164±0.007。各組間磷酸化水平無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　3 U0126抑制了由睪酮引起的神經(jīng)元樹突棘密度的快速增加
　　原代海馬神經(jīng)元經(jīng)U0126處理1 h后，繼而給予睪酮和睪酮-牛血清白蛋白作用，抗Drebrin的免

47、疫熒光細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到神經(jīng)元樹突棘密度的結(jié)果顯示， Con組為1.01±0.18、T組為0.98±0.19、T-BSA組為1.03±0.21、F+T組為1.02±0.14。數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)各組間無(wú)差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1睪酮和睪酮-牛血清白蛋白均可引起ERK/MAPK和CREB的快速磷酸化。
　　2 U0126可以抑制由睪酮和睪酮-牛血清白蛋白引起的 ERK/MAPK和CREB磷酸化。