抗菌肽Cec-Nis-Lfm的串聯(lián)表達(dá)及對(duì)雞腸炎沙門氏菌抑菌機(jī)理初步研究.pdf

1、隨著抗生素藥物和化學(xué)防腐劑的大量使用，細(xì)菌耐藥性及防腐劑在食品中殘留等問(wèn)題越來(lái)越引起人們的關(guān)注。近年來(lái)研究開(kāi)發(fā)不易產(chǎn)生耐藥性抗菌藥物和天然防腐劑成為研究熱點(diǎn)之一。研究表明，抗菌肽具有高效的抗菌活性及獨(dú)特的抗菌機(jī)制，不易產(chǎn)生耐藥性，而且還具分子量小、安全無(wú)毒、水溶性好、熱穩(wěn)定性好、抗真菌、病毒以及抗腫瘤等特點(diǎn)，引起了國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。因此，抗菌肽成為最具開(kāi)發(fā)前景的抗生素替代品和新型安全食品防腐劑。
　　本研究將幾種不同來(lái)源的抗

2、菌串聯(lián)表達(dá)，作為復(fù)合抗菌肽研究其生物活性及抑菌機(jī)理，根據(jù) Genbank中 Cecropin、Nisin、LfcinB和 MagaininⅡ抗菌肽序列，選取LfcinB和MagaininⅡ的核心功能序列，組合成新型抗菌肽 Lfm。用酵母的Kex2酶裂解位點(diǎn)識(shí)別序列（GAG AAA AGA）將Cecropin、Nisin和Lfm的核苷酸序列串聯(lián)起來(lái)，并在兩端插入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)識(shí)別序列、保護(hù)堿基和終止密碼子，選取畢赤酵母基因翻譯

3、偏好密碼子，人工設(shè)計(jì)合成復(fù)合抗菌肽Cec-Nis-Lfm基因，克隆到真核表達(dá)載體 pPICZαA中構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZαA-CNL，雙切鑒定后的重組載體經(jīng) SacⅠ線性化后電轉(zhuǎn)入畢赤酵母 X-33、GS115和 SMD1168中，經(jīng) Zeocin抗性篩選、PCR鑒定以及測(cè)序鑒定篩選高拷貝陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)，SMD1168在預(yù)期位置出現(xiàn)相應(yīng)的特異條帶，對(duì)目的條帶進(jìn)行 LC

4、-MS/MS膠條鑒定，三種抗菌肽均被檢測(cè)到，用 BCA蛋白濃度試劑盒檢測(cè)抗菌肽濃度為493.36μg/mL。用牛津杯法檢測(cè)抗菌肽CNL對(duì)雞腸炎沙門氏菌（Salmonellaenteritidis）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）以及痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae）的抑菌活性，均出現(xiàn)明顯的抑菌圈，對(duì)雞腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和痢疾志賀氏菌的抑菌圈平均直徑為36.97mm、30.21

5、mm和31.53mm；MIC為10.32μg/mL、12.88μg/mL和15.44μg/mL。為研究其抑菌機(jī)理，對(duì)抗菌肽CNL處理雞腸炎沙門氏菌上清液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和 SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)隨著處理時(shí)間的增加，上清液中 DNA的含量以及蛋白質(zhì)組成均發(fā)生變化，初步驗(yàn)證了抗菌肽CNL作用于細(xì)胞膜。用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察經(jīng)抗菌肽CNL處理過(guò)的雞腸炎沙門氏菌細(xì)胞膜，與對(duì)照組相比，隨著處理時(shí)間增加，細(xì)胞膜皺褶更加明顯，細(xì)胞有內(nèi)容物流出的現(xiàn)