豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫對(duì)仔豬消化道局部和全身免疫水平的影響.pdf

1、豬傳染性胃腸炎是由豬傳染性胃腸炎病毒引起的一種高度接觸性傳染病，主要通過(guò)消化道進(jìn)行傳播，能引起2周齡以下仔豬嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、脫水和高死亡率。通過(guò)消化道口服免疫可直接切斷豬傳染性胃腸炎病毒的感染和傳播途徑，有效控制豬傳染性胃腸炎的發(fā)生。然而滅活全病毒單獨(dú)口服免疫不足以有效激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答，需選擇合適的黏膜佐劑來(lái)增強(qiáng)疫苗的免疫原性，進(jìn)而達(dá)到良好的免疫效果。近年來(lái)利用CpG作為黏膜免疫增強(qiáng)劑已成為疫苗領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。CpG作為有效的黏膜佐劑

2、在小鼠上已有大量研究，但在豬上其相關(guān)報(bào)道較少。因此本試驗(yàn)通過(guò)體外和體內(nèi)試驗(yàn)研究探討CpG配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫對(duì)仔豬消化道局部和全身免疫水平的影響，為研究應(yīng)激性小、保護(hù)力高的豬傳染性胃腸炎口服疫苗奠定基礎(chǔ)。首先，通過(guò)體外試驗(yàn)檢測(cè)CpG對(duì)豬脾臟淋巴細(xì)胞的免疫刺激作用。其次，在仔豬腸結(jié)扎試驗(yàn)中，探討CpG配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒對(duì)腸黏膜組織中細(xì)胞因子IL-6、IL-12和IFN-γmRNA水平的影響;在仔豬免疫試驗(yàn)中，選取20

3、頭6周齡三元雜交仔豬，隨機(jī)分為5組進(jìn)行首次免疫，一周后進(jìn)行二次免疫，正常飼養(yǎng)，首免后42天宰殺，應(yīng)用組織學(xué)切片技術(shù)檢測(cè)回腸CD3+T淋巴細(xì)胞、上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(IEL)的數(shù)目，以此評(píng)估CpG配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫對(duì)消化道局部細(xì)胞免疫水平的影響。另外，通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)回腸組織中IgA分泌細(xì)胞的陽(yáng)性面積，間接ELISA法檢測(cè)糞便和小腸組織中豬傳染性胃腸炎病毒特異性SIgA抗體水平，探討豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫對(duì)消化道局部

4、體液免疫水平的影響;通過(guò)檢測(cè)血清中豬傳染性胃腸炎病毒特異性IgG抗體水平來(lái)探討豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫對(duì)全身體液免疫水平的影響。本研究?jī)?nèi)容分為以下四個(gè)部分:
　　1 CpG對(duì)豬脾臟淋巴細(xì)胞的增殖刺激作用
　　用細(xì)菌CpG-DNA、人工合成的CpG-ODN、豬傳染性胃腸炎滅活病毒、CpG-DNA配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒刺激豬脾臟淋巴細(xì)胞72 h，檢測(cè)幾種處理對(duì)豬脾臟淋巴細(xì)胞的增殖作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn):CpG-DNA和CpG-

5、ODN均能在體外72 h內(nèi)誘導(dǎo)豬脾臟淋巴細(xì)胞顯著增殖，且二者的刺激指數(shù)之間無(wú)顯著差異;CpG配合TGEV能刺激豬的脾臟淋巴細(xì)胞顯著增殖。本試驗(yàn)結(jié)果表明CpG對(duì)豬脾臟淋巴細(xì)胞具有良好的免疫刺激作用，為后續(xù)的動(dòng)物試驗(yàn)提供了重要參考。
　　2豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫對(duì)豬消化道局部細(xì)胞免疫水平的影響仔豬回腸結(jié)扎后注射豬傳染性胃腸炎滅活病毒和CpG，6h后宰殺采集回腸組織，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)IL-6、IL-12和IFN-

6、γ mRNA的表達(dá)量。結(jié)果表明:應(yīng)用CpG配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒，小腸中IL-6、IL-12和IFN-γ mRNA水平顯著升高;單獨(dú)應(yīng)用CpG也能增加IL-6、IL-12和IFN-γ mRNA的表達(dá)水平;單獨(dú)應(yīng)用豬傳染性胃腸炎滅活病毒不能使IL-6和IFN-γ mRNA水平增加，但能增加IL-12的mRNA表達(dá)量。
　　仔豬口服免疫后42天宰殺，采集回腸組織進(jìn)行固定，石蠟包埋并制作組織學(xué)切片，應(yīng)用免疫組化法顯示回腸CD3+T淋

7、巴細(xì)胞分布和數(shù)量變化，結(jié)果表明:應(yīng)用CpG配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫能夠顯著增加回腸絨毛處CD3+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量。
　　應(yīng)用HE染色法顯示豬回腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞分布和數(shù)量變化。結(jié)果表明:應(yīng)用CpG配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫后，回腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)目顯著增加。
　　以上三個(gè)試驗(yàn)結(jié)果提示，應(yīng)用CpG配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫可有效誘導(dǎo)仔豬消化道局部細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　3豬傳染性胃腸炎滅活病毒

8、口服免疫對(duì)豬消化道局部體液免疫水平的影響
　　應(yīng)用免疫組化法顯示仔豬回腸IgA分泌細(xì)胞。結(jié)果表明:應(yīng)用CpG配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫能夠顯著增加仔豬回腸IgA分泌細(xì)胞的面積。
　　應(yīng)用間接ELISA法每周監(jiān)測(cè)糞便中豬傳染性胃腸炎病毒特異性SIgA抗體水平，結(jié)果表明:首免后前三周，應(yīng)用CpG配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫能夠顯著提高鼻糞便中特異性SIgA抗體水平;單獨(dú)應(yīng)用豬傳染性胃腸炎滅活病毒也能顯著提高糞便中特

9、異性SIgA抗體水平，但效果不如CpG配合組。首免第四周時(shí)，口服免疫組中豬傳染性胃腸炎病毒特異性SIgA抗體水平逐漸下降，各組之間無(wú)顯著差異。
　　應(yīng)用間接ELISA法檢測(cè)回腸組織中特異性IgA抗體水平，結(jié)果表明:單獨(dú)應(yīng)用豬傳染性胃腸炎滅活病毒或與CpG配合口服免疫45天后，回腸組織中特異性IgA抗體的水平仍顯著高于對(duì)照組;皮下注射豬傳染性胃腸炎滅活病毒組腸組織中特異性IgA抗體水平無(wú)顯著變化。
　　以上三個(gè)試驗(yàn)結(jié)果提示，應(yīng)

10、用CpG配合豬傳染性胃腸炎病毒口服免疫可有效誘導(dǎo)仔豬消化道局部體液免疫應(yīng)答。
　　4豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫對(duì)豬全身免疫水平的影響
　　應(yīng)用間接ELISA法每周監(jiān)測(cè)血清中豬傳染性胃腸炎病毒特異性IgG抗體水平，結(jié)果表明:皮下注射TGEV滅活病毒組血清中IgG水平最高，且一直較穩(wěn)定;在免疫早期，CpG配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫能夠顯著提高血清中特異性IgG抗體的水平，效果接近皮下注射組;單獨(dú)應(yīng)用豬傳染性胃腸炎滅活