乳酸菌載體系統(tǒng)表達(dá)豬傳染性胃腸炎病毒N蛋白及其對(duì)小鼠免疫效力的研究.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(Transmissiblegastroenteritis，TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV)引起的豬的一種急性高度接觸性傳染病。該病廣泛分布于世界各地，給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重危害。結(jié)合TGEV的致病特點(diǎn)、免疫特性探索開發(fā)安全、廉價(jià)、效力穩(wěn)定的新型疫苗對(duì)預(yù)防該病具有重要的意義。乳酸菌被公認(rèn)為安全級(jí)(generallyrecognizedassafe，GR

2、AS)微生物，是作為黏膜免疫的活載體的理想選擇。近二十年來，對(duì)于表達(dá)外源抗原的乳酸菌作為口服免疫活載體疫苗的研究已經(jīng)受到了廣泛的重視并取得了一定進(jìn)展。 本研究以含有豬傳染性胃腸炎病毒N基因的重組質(zhì)粒pHN為模板，利用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)并合成2對(duì)TGEVN基因引物，通過PCR分別擴(kuò)增出兩端含有NcoI、SacI酶切位點(diǎn)N基因片段和含有BamHI、XholI酶切位點(diǎn)的N基因片段。將含有NcoI、SacI酶切位點(diǎn)N基因片段克隆到

3、pMD18-T載體上，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD18-T-N。對(duì)pMD18-T-N進(jìn)行鑒定后，將粘性末端的N基因與乳酸乳球菌表達(dá)載體pNZ8048連接，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至乳酸乳球菌NZ9000中，得到含有重組表達(dá)載體pNZ8048-N的乳酸乳球菌pNZ8048-N/NZ9000。用1ng/ml的乳酸鏈球菌肽nisin誘導(dǎo)重組菌后，SDS-PAGE和Western-blot分析表達(dá)產(chǎn)物，得到與預(yù)計(jì)大小相符的43kD重組蛋白，說明N基因在乳酸乳球菌

4、表達(dá)系統(tǒng)中獲得表達(dá)。光密度掃描對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步定量，表明重組蛋白約為菌體總蛋白的8.3％。將含有BamHI、XholI酶切位點(diǎn)N基因片段克隆到pGEM-T載體上，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEM-T-N。對(duì)pGEM-T-N進(jìn)行鑒定后，將粘性末端的N基因與干酪乳桿菌表達(dá)載體pPG611.1連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109中，獲得重組表達(dá)載體pPG611.1-N。對(duì)pPG611.1-N進(jìn)行鑒定后，將其電轉(zhuǎn)化至干酪乳桿菌Lactobacillu

5、scasei393中，得到含有pPG611.1-N表達(dá)載體的干酪乳桿菌pPG611.1-N/Lactobacilluscasei393。用1％核糖和1％乳糖誘導(dǎo)重組干酪乳桿菌后，SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果顯示1％核糖誘導(dǎo)的重組干酪乳桿菌產(chǎn)生預(yù)計(jì)大小相符的49kD的融合蛋白，說明N基因在干酪乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)中獲得表達(dá)。光密度掃描對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步定量，表明重組蛋白約為菌體總蛋白的2.7％。將重組乳酸乳球菌懸液和菌體裂解物分別通過口服