仔豬病毒性腹瀉病流行病學調查及豬傳染性胃腸炎乳酸桿菌口服疫苗研究.pdf

1、仔豬病毒性腹瀉主要是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)和豬輪狀病毒(Porcine rotavirus，PoRV)單獨或混合感染引起，該病對仔豬的危害較大，病死率高。自2010年冬季以來，山東省部分地區(qū)仔豬發(fā)生以腹瀉為主要癥狀的疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經濟損失。其中豬傳染性

2、胃腸炎是引起仔豬腹瀉的主要病因之一，該病可造成10日齡以內的仔豬100％死亡。TGEV主要感染胃腸道引起局部組織發(fā)生病變,胃腸道黏膜免疫可以有效預防病毒感染，而口服疫苗可刺激機體產生胃腸道黏膜免疫。本實驗室已經成功構建好TGEV的乳酸桿菌口服疫苗。為了解山東省仔豬病毒性腹瀉病病原的感染流行情況和TGEV乳酸桿菌口服疫苗的免疫情況，本研究進行了以下幾個方面的工作:
　　1.仔豬病毒性腹瀉病病原流行病學調查
　　本研究采用RT-

3、PCR方法對2013年10月～2014年10月從山東濟南、濰坊、濟寧等10個地市豬場采集的226份腹瀉樣品進行檢測。結果顯示，PEDV、TGEV與PoRV的檢出率分別為34.96％、2.21％和28.76％，并且不同季節(jié)PEDV和PoRV均有感染，表明PEDV和PoRV是引起山東省仔豬腹瀉的主要病因，并且山東省PoRV的檢出率明顯高于全國（劉云波等，2013）。規(guī)?；i場與散養(yǎng)戶相比，PEDV、TGEV、PoRV3種病原的檢出率明顯降低

4、，而且相對于未免疫腹瀉二聯(lián)苗的母豬而言，免疫后的母豬生產的仔豬發(fā)生腹瀉后，該病原的檢出率有所降低，表明合理的飼養(yǎng)環(huán)境和免疫對該病具有防控作用。
　　2.TGEVSA基因的原核表達及間接ELISA方法的建立
　　設計針對SA基因的特異性檢測引物，以實驗室保存的質粒pUC-S為模板PCR擴增TGEV的SA基因，并連接到pET-30a載體上，構建了重組表達質粒，導入表達菌E.coliBL21，并進行了表達條件（IPTG濃度、溫度、

5、轉速、時間）優(yōu)化。結果表明，在1mM/mL的IPTG，37℃，200r/min，表達6h時SA蛋白表達量最大。經過Ni-Agarose柱純化獲得純度較高的目的蛋白，Western blot檢測表明，表達的重組SA蛋白能與TGEV陽性血清發(fā)生特異性反應，不與其他常見豬病陽性血清發(fā)生反應，說明該蛋白具有一定的反應原性。以表達的SA蛋白為包被抗原建立間接ELISA方法，采用方陣滴定法確定抗體最佳稀釋度是1∶100，抗原的包被濃度為0.75ug

6、/ml。
　　3.豬傳染性胃腸炎乳酸桿菌口服疫苗研究
　　本研究將已經構建好的含有TGEV的A、D抗原位點和乳酸桿菌復制子基因Rep.8014的重組真核質粒pRc/CMV2-SAD-Rep.8014電轉到豬源乳酸桿菌中，口服免疫6～8周齡BALB/c小鼠，并以乳酸桿菌組和商品疫苗組作為對照。分別在免疫前、二免前、二免疫后7d、14d、21d、28d采集小鼠血液收集血清檢測特異性IgG抗體、IL-4和IFN-γ，并在免疫前和免

7、疫后每間隔2周各處死2只小鼠，取脾臟檢測CD4+T和CD8+T細胞的百分率，同時收集并制備小鼠的腸液樣本檢測特異性SIgA抗體。檢測結果顯示，口服免疫組中IgG抗體、IFN-γ以及CD4+T和CD8+T細胞在淋巴細胞中的百分含量與商品疫苗組差異較小，但均明顯高于乳酸桿菌對照組;IL-4只有在二免后14d含量才有所提高，其余時間變化不明顯;口服免疫組14d后檢測的腸液中的特異性SIgA抗體含量高于商品疫苗組，且差異顯著(P＜0.05)。結