MicroRNA-136對RIG-I信號通路雙重調(diào)控及在A549細(xì)胞上抑制H5N1流感病毒復(fù)制機(jī)制的研究.pdf

1、H5N1亞型流感病毒在禽和包括人類在內(nèi)的哺乳動物中引起嚴(yán)重的呼吸道疾病，并誘發(fā)很高的死亡率。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的研究調(diào)查報告，H5N1流感病毒在人群中可導(dǎo)致高達(dá)60％的死亡率。因此，為了控制病毒傳播和擴(kuò)散，研究有效預(yù)防或者治療流感病毒感染的藥物已是當(dāng)務(wù)之急。microRNA作為一種多功能調(diào)節(jié)因子，正日益被廣泛地研究并用作抑制病毒感染的潛在治療藥物。然而，關(guān)于闡釋microRNA在調(diào)控病毒與宿主相互作用關(guān)系的機(jī)制研究仍然十分匱乏。我們之前的

2、microRNA芯片結(jié)果顯示，A/duck/Hubei/hangmei01/2006（簡稱H5N1/HM）病毒感染A549細(xì)胞后，有一小部分microRNA表達(dá)發(fā)生異常，其中miR-136誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)最為明顯，上調(diào)達(dá)到5倍。隨后我們選取其中三個差異表達(dá)的microRNA分別檢測它們是否影響 H5N1/HM病毒增殖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， miR-136在 A549細(xì)胞上具有很強(qiáng)的抑制H5N1/HM病毒復(fù)制效果，同時也對A/chicken/Hubei

3、/327/2004（簡稱H5N1/DW）病毒以及VSV病毒的復(fù)制都有很好的抑制效果。接下來，我們對miR-136發(fā)揮抗病毒活性的分子機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)研究。
　　主要研究內(nèi)容如下：
　　1 miR-136靶基因的預(yù)測、篩選和驗證：
　　我們用microRNA靶標(biāo)在線預(yù)測軟件miRanda、TargetScan、PITA和RNA22等在基因組范圍內(nèi)對miR-136的靶位點進(jìn)行了預(yù)測，經(jīng)過分析并篩選了43個候選靶基因，這些候選

4、靶基因同時被兩個軟件預(yù)測到有靶點或者功能上與病毒復(fù)制周期密切相關(guān)。隨后，我們克隆這些基因的3’UTR序列并連接至雙熒光素酶報告載體pmirGLO質(zhì)粒上。經(jīng)過實驗篩選，我們最終確定并實驗驗證IL-6是miR-136的一個調(diào)控靶基因。靶點突變和刪除實驗證實了miR-136在IL-6 mRNA上的有效靶點位置，并且我們用生物素化的miR-136成功富集了IL-6的mRNA。而且，在poly（I:C）刺激或者病毒感染的狀態(tài)下，miR-136能夠

5、很明顯的負(fù)調(diào)控IL-6的表達(dá)。該實驗結(jié)果表明，miR-136是IL-6真實的負(fù)調(diào)控因子。但是令人意外的是，當(dāng)我們研究miR-136對內(nèi)源性IL-6表達(dá)的影響時，發(fā)現(xiàn)IL-6 mRNA、胞內(nèi)IL-6蛋白、分泌型IL-6蛋白表達(dá)量都急劇上升。這提示miR-136參與了其它免疫通路的調(diào)控，而不僅限于對IL-6靶點的調(diào)控。
　　2 miR-136是RIG-I受體分子的配體
　　據(jù)報道，dsRNA可以作為TLRs、RIG-I、PKR等

6、免疫分子的配體而誘發(fā)強(qiáng)烈的天然免疫反應(yīng)，并最終表現(xiàn)為其下游效應(yīng)分子的大量表達(dá)，如TNF-α、IL-6、IFN-β、OASL等。而dsRNA的這種免疫激活能力可以被其內(nèi)部堿基化學(xué)修飾而消除。我們的研究發(fā)現(xiàn)，2’-O-methyl修飾的miR-136免疫激活能力消失，而且在免疫不敏感細(xì)胞293T細(xì)胞上也幾乎不能誘導(dǎo)IL-6和IFN-β的表達(dá)。根據(jù)這個特性，我們斷定miR-136很有可能具有激活某種模式識別受體分子的能力。
　　隨后我們

7、對TLRs、RIG-I、PKR受體分子進(jìn)行了篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默RIG-I分子后，miR-136的免疫激活能力顯著下降。另外，miR-136與RIG-I分子在誘導(dǎo)天然免疫過程中具有明顯的協(xié)同加強(qiáng)效應(yīng)。miR-136能夠誘導(dǎo)包括RIG-I在內(nèi)的多數(shù)免疫基因的表達(dá)，這一性質(zhì)與已知RIG-I配體分子miR-145非常類似。實驗結(jié)果證實，這兩個microRNA都能誘導(dǎo)RIG-I蛋白的上調(diào)表達(dá)，同時化學(xué)修飾的miR-136能夠明顯競爭抑制miR-1

8、45誘導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)。因此，所有這些證據(jù)加強(qiáng)了這樣一個假設(shè)：即RIG-I最有可能是miR-136的免疫受體分子。然而，為了進(jìn)一步證明該假設(shè)，我們用間接熒光免疫實驗證實了miR-136與RIG-I在細(xì)胞質(zhì)中存在共定位。而且用RNA免疫沉淀技術(shù)以及miR-136 pulldown技術(shù)共同證明了miR-136與RIG-I之間存在直接的物理相互作用關(guān)系。
　　另外，為了知道內(nèi)源miR-136是否足夠參與調(diào)控RIG-I通路，我們用miR-

9、136特異性抑制物（inhibitor）抑制細(xì)胞內(nèi)源miR-136表達(dá)，并檢測RIG-I、IL-6、IFN-β表達(dá)水平，結(jié)果證明這些免疫分子表達(dá)受到明顯負(fù)調(diào)控。進(jìn)一步實驗結(jié)果顯示，由miR-136引起的免疫水平削弱一定程度促進(jìn)了流感病毒和VSV病毒的增殖。
　　3 miR-136小鼠保護(hù)實驗
　　當(dāng)我們將miR-136通過尾靜脈注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)后再攻毒，發(fā)現(xiàn)注射miR-136能使小鼠體重下降更緩慢，延長小鼠存活時間2-3天，

10、并顯著減少小鼠肺臟病毒載量。我們對肺臟IL-6、IFN-β和RIG-I分子檢測發(fā)現(xiàn)，miR-136可誘導(dǎo)較高水平的IFN-β和RIG-I水平，而同時抑制IL-6水平的急劇增高，這一結(jié)果與小鼠體重變化和死亡情況非常相符。雖然miR-136實驗組小鼠全部死亡，但是miR-136抑制病毒增殖的效果不能忽略。
　　4 miR-136激活RIG-I受體的結(jié)構(gòu)特點
　　我們對miR-136激活RIG-I分子的分子機(jī)制作了初步的探索。實驗

11、結(jié)果顯示， miR-136分子中的poly(UUUU)序列以及5’端堿基序列對miR-136的免疫激活能力必不可少，這兩個位點的序列突變都將導(dǎo)致其免疫激活能力喪失。而3’端序列的變化對其免疫激活能力影響不大。另一方面，miR-136雙鏈序列的長度對其功能也具有決定作用。5’或3’堿基的截短都會導(dǎo)致其免疫激活作用嚴(yán)重削弱甚至消失。因此， miR-136序列特異性和必要的長度是決定其具備免疫激活能力的關(guān)鍵因素。然而，究其激活RIG-I受體分