RNA解旋酶Rig-I對(duì)巨噬細(xì)胞的影響及作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分Rig-I對(duì)巨噬細(xì)胞的數(shù)量及凋亡的影響
　　摘要RIG-I（retinoic acid-inducible gene-I）最初是在全反式維甲酸（all trans-retinoic acid，ATRA）誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）細(xì)胞系NB4分化過程中被發(fā)現(xiàn)顯著上調(diào)的基因。目前普遍認(rèn)為，Rig-I是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)病原模式識(shí)別受體的一種，通過特異性識(shí)別外源RNA在宿主

2、抗病毒先天免疫功能中發(fā)揮重要作用。在病毒感染情況下，Rig-I通過其RD結(jié)構(gòu)域識(shí)別相應(yīng)病毒RNA，與下游信號(hào)分子IPS-1（Interferon-beta promoter stimulator1，MAVS/Cafrdif/VISA）發(fā)生相互作用，從而激活下游的IRF3（IFN regulatory factor3）和NF-κB信號(hào)通路，產(chǎn)生I型干擾素和炎癥因子，抵抗病毒入侵。但在我們以往的研究中，意外發(fā)現(xiàn)Rig-I基因缺失小鼠的抗細(xì)菌

3、免疫能力低下，易發(fā)生條件性致病菌感染。Rig-I基因剔除純合子小鼠由于B細(xì)胞分化缺陷和免疫球蛋白轉(zhuǎn)換受阻導(dǎo)致眼部及頸部皮膚易發(fā)生條件性致病菌-木糖型葡萄球菌（S.xylosus）感染。另外Rig-I基因剔除小鼠容易發(fā)生結(jié)腸炎、T細(xì)胞活化缺陷和粒細(xì)胞的過度增殖。這說(shuō)明Rig-I在抗病毒以外，在細(xì)菌免疫反應(yīng)中也發(fā)揮重要作用。另外細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)Rig-I可以通過調(diào)節(jié)GTP酶家族Rac/Cdc42的活性來(lái)影響細(xì)胞骨架蛋白actin的重組，從而促進(jìn)

4、巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬能力，Rig-I基因剔除小鼠對(duì)E.coli的吞噬能力減弱。巨噬細(xì)胞是天然免疫免疫系統(tǒng)防御體系的重要一員。我們利用現(xiàn)有的Rig-I基因剔除小鼠模型，采用流式細(xì)胞術(shù)的方法，對(duì)小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞總數(shù)和凋亡以及大巨噬細(xì)胞（Large peritioneal macrophages，LPM）和小巨噬細(xì)胞（Small peritoneal macrophages，SPM）的數(shù)量進(jìn)行分析。與野生型小鼠相比，Rig-I基因敲除小鼠腹

5、腔巨噬細(xì)胞的總數(shù)明顯減少、凋亡增加以及腹腔巨噬細(xì)胞LPM和SPM的數(shù)量上都發(fā)生顯著減少。這說(shuō)明Rig-I對(duì)小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞的數(shù)量起著重要調(diào)節(jié)作用，這可能與Rig-I基因敲除的小鼠易發(fā)生條件致病菌感染存在某種的聯(lián)系。
　　第二部分Rig-I對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞增殖、凋亡及功能的作用研究
　　摘要位于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜的脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）是巨噬細(xì)胞的潛在激活劑。LPS通過激活TLR4啟

6、動(dòng)天然免疫反應(yīng)。本研究我們以LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞為模型，探討Rig-I基因?qū)PS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞因子分泌等生物學(xué)功能的影響及其作用機(jī)制。以不同劑量的LPS刺激Rig-I基因沉默和過表達(dá)的小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7細(xì)胞，采用CCK8和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)；采用qPCR方法檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α、IL-10、IL-1和IL-6相關(guān)基因的表達(dá)水平；利用transwell檢測(cè)巨噬細(xì)胞的遷移；對(duì)巨噬細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附作

7、用進(jìn)行分析；采用Western blot方法檢測(cè)LPS誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)通路的相關(guān)蛋白表達(dá)水平。CCK8和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示Rig-I促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖并抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，qPCR結(jié)果表明Rig-I促進(jìn)巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-10、IL-1和IL-6基因的表達(dá)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)Rig-I通過激活A(yù)KT及其下游蛋白p-38、NF-κB和Bcl-xL等抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞因子的表達(dá)。因此，本研究首次證實(shí)了Rig-I可通過AKT信