豬維甲酸誘導(dǎo)基因I(RIG-I)的克隆及其在誘導(dǎo)-型干擾素中的作用研究.pdf

1、機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)在抵抗病毒感染方面發(fā)揮著重要作用。病毒感染宿主細(xì)胞后，宿主細(xì)胞可以通過模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）偵測(cè)病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecularpatterns，PAMPs）的存在，從而激活宿主的天然免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)干擾素（IFN）、促炎癥細(xì)胞因子等一系列抗病毒因子的產(chǎn)生。Toll樣受體（Toll-likereceptor，TLR）家族

2、是一類重要的PRR，在RNA病毒的識(shí)別過程中發(fā)揮重要作用，如TLR3識(shí)別dsRNA：TLR7和TLR8識(shí)別ssRNA等。但由于TLR家族成員均為跨膜蛋白，只能識(shí)別細(xì)胞外或內(nèi)體中的RNA病毒，對(duì)于細(xì)胞質(zhì)中的RNA病毒，TLR則無(wú)法做出反應(yīng)。RIG-Ⅰ樣受體（RIG-I-like receptor，RLR）是一類新發(fā)現(xiàn)的PRR，能夠識(shí)別細(xì)胞質(zhì)中的病毒RNA，誘導(dǎo)干擾素和促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，對(duì)抗病毒天然免疫的建立起著至關(guān)重要的作用。

3、　　 對(duì)人RIG-Ⅰ基因的結(jié)構(gòu)、誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生的機(jī)制等已研究較為清楚，但有關(guān)豬RIG-Ⅰ的研究尚無(wú)報(bào)道，鑒于此，本研究對(duì)豬RIG-Ⅰ進(jìn)行了克隆，并對(duì)其在誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素中的作用做了初步研究。
　　 主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 1.豬RIG-Ⅰ基因克隆與序列分析。
　　 取豬的外周血單核細(xì)胞總RNA作模板RT-PCR（一步法）擴(kuò)增豬RIG-Ⅰ基因，插入pMD18-T載體中構(gòu)建了克隆質(zhì)粒pMD18-RIG-Ⅰ，序列分析

4、發(fā)現(xiàn)豬RIG-Ⅰ開放讀碼框全長(zhǎng)為2832 bps，編碼943個(gè)氨基酸殘基。與牛、馬、人、黑猩猩、猴的氨基酸同源性分別為82.3％、80.2％、80.2％、79.7％、和78.8％，與小鼠、大鼠和鴨嘴獸的同源性較低，進(jìn)化系統(tǒng)樹分析也表明豬RIG-Ⅰ氨基酸序列與牛的親緣關(guān)系最近。
　　 2.豬RIG-Ⅰ基因全長(zhǎng)及突變體重組質(zhì)粒的構(gòu)建。
　　 以pMD18-RIG-Ⅰ為模板，PCR分別擴(kuò)增RIG-Ⅰ全長(zhǎng)編碼區(qū)、RIG-ⅠN端以

5、及RIG-ⅠC端編碼區(qū)片段，將純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后分別與經(jīng)同樣酶切的真核表達(dá)載體pCMV-Tag-2B連接，獲得的重組質(zhì)粒分別命名為Tag-RIG-Ⅰ，Tag-RIG-Ⅰ-N和Tag-RIG-Ⅰ-C。
　　 3.豬RIG-Ⅰ在誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生中的作用。
　　 將真核表達(dá)質(zhì)粒Tag-RIG-Ⅰ、Tag-RIG-Ⅰ-N、Tag-RIG-Ⅰ-C分別轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，通過熒光素酶報(bào)道系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)