血管內(nèi)皮鈣黏蛋白外功能區(qū)脫落對(duì)內(nèi)皮通透性的影響及在嚴(yán)重膿毒癥中的意義.pdf

1、背景膿毒癥尤其嚴(yán)重膿毒癥仍是面臨的主要健康問(wèn)題之一,是重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)病人的首要死亡因?yàn)?。?nèi)皮細(xì)胞激活、功能障礙和損傷是嚴(yán)重膿毒癥及多器官功能障礙綜合征(MODS)的重要特征。內(nèi)皮通透性增高所致微血管滲漏是嚴(yán)重膿毒癥和MODS的重要病理生理。血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)為內(nèi)皮細(xì)胞特異性膜蛋白,是內(nèi)皮細(xì)胞之間黏附連接的主要成分。VE-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞間同型黏附在內(nèi)皮屏障和內(nèi)皮細(xì)胞其他功能的控制方面具有關(guān)鍵作用

2、。本研究擬:(1)探討內(nèi)皮細(xì)胞體外研究模型的選擇；(2)研究VE-cadherin胞外區(qū)即外功能區(qū)脫落在內(nèi)皮通透性增高中的作用；(3)檢測(cè)嚴(yán)重膿毒癥病人血清可溶性VE-cadherin(VE-cadherin外功能區(qū))水平,并探討其與疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后的關(guān)系。
　　 材料和方法：用原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)作為陽(yáng)性對(duì)照,從蛋白水平和mRNA水平分析廣泛作為內(nèi)皮細(xì)胞體外研究模型的ECV304細(xì)胞系VE-cadherin的表達(dá)

3、。以重組人基質(zhì)金屬蛋白酶9(rMMP-9)裂解VE-cadherin胞外區(qū),研究VE-cadherin外功能區(qū)脫落對(duì)內(nèi)皮通透性、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和RhoA的影響。收集入住SICU的重癥病人28例,其中嚴(yán)重膿毒癥15例,非膿毒癥重癥病人13例,健康志愿者13例。對(duì)比分析嚴(yán)重膿毒癥血清可溶性鈣黏蛋白水平,并分析和APACHEⅡ評(píng)分及死亡的相關(guān)性。內(nèi)皮細(xì)胞VE-cadherin的蛋白水平檢測(cè)采用免疫熒光法(IF)和免疫印跡法(WB)。VE-c

4、adherin在mRNA水平的檢測(cè)應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。內(nèi)皮通透性測(cè)定采用FITC-葡聚糖透過(guò)Transwell方法測(cè)定。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架采用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色熒光顯微鏡下觀察。RhoA表達(dá)以WB法檢測(cè)。細(xì)胞培養(yǎng)液和人血清可溶性VE-cadherin檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(Elisa)。
　　 結(jié)果：(1)已廣泛用作內(nèi)皮細(xì)胞體外研究模型的ECV304細(xì)胞系在蛋白水平和mRNA水平均未檢測(cè)到VE-cadhe

5、rin。(2)VE-cadherin外功能區(qū)脫落明顯增高了內(nèi)皮通透性；激活內(nèi)皮細(xì)胞RhoA,引起肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組和內(nèi)皮細(xì)胞間隙形成；(3)和健康志愿者及非嚴(yán)重膿毒癥的重癥病人相比,嚴(yán)重膿毒癥病人血清可溶性VE-cadherin水平明顯增高(P<0.0001)。重癥病人血清可溶性VE-cadherin水平和APACHEⅡ評(píng)分呈直線相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r=0.577,P<0.01)。嚴(yán)重膿毒癥死亡者血清可溶性VE-cadherin水平明顯高于

6、生存者(P<0.01)。最后,我們用嚴(yán)重膿毒癥病人血清刺激HUVEC,發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞連接處VE-cadherin明顯減少,并且VE-cadherin總量明顯降低。
　　 結(jié)論：(1)ECV304細(xì)胞系不表達(dá)VE-cadherin,缺乏內(nèi)皮細(xì)胞重要特征,不應(yīng)作為內(nèi)皮細(xì)胞體外研究模型；(2)VE-cadherin外功能區(qū)脫落后可發(fā)生由外向內(nèi)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,激活RhoA,引起肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組和內(nèi)皮細(xì)胞間隙形成,對(duì)內(nèi)皮通透性具有重