Zeste基因增強(qiáng)子同源物1,2介導(dǎo)miR-214抑制心肌纖維化的作用研究.pdf

1、本文將利用Ang-Ⅱ灌注小鼠誘導(dǎo)心肌纖維化動(dòng)物模型、Ang-Ⅱ處理心肌成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)心肌纖維化細(xì)胞模型，通過雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，mimics介導(dǎo)過表達(dá)miR-214-3p，siRNAs介導(dǎo)分別沉默EZH1和EZH2表達(dá)等方法，在整體和細(xì)胞水平上明確miR-214在心肌纖維化中的作用;研究miR-214-3p是否能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控EZH1和EZH2表達(dá);驗(yàn)證上述靶基因是否介導(dǎo)了miR-214-3p對(duì)心肌纖維化的調(diào)控作用。本文將闡明心肌重構(gòu)中

2、miR-214-3p調(diào)控心肌纖維化的分子機(jī)制，為基于miRNAs的心肌纖維化治療研究提供科學(xué)依據(jù)。
　　第一章 miR-214在小鼠纖維化心肌中的表達(dá)
　　目的:建立小鼠心肌纖維化的動(dòng)物模型，明確miR-214在發(fā)生重構(gòu)小鼠心肌組織中的表達(dá)情況。
　　方法:1.選取SPF級(jí)體重約20～25 g的雄性C57/BL6小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過植入Ang-Ⅱ膠囊滲透泵(1.46 mg/kg/2w)建立心肌纖維化的動(dòng)物模型。模型組和

3、假手術(shù)組各8只;2.采用尾壓法檢測小鼠收縮壓，并測量心臟重量與脛骨長度，計(jì)算相應(yīng)比值;3.動(dòng)物B超檢測小鼠心肌結(jié)構(gòu)與心功能相關(guān)指標(biāo);4.采用Masson三色染色對(duì)小鼠心肌組織進(jìn)行膠原纖維的染色觀察;5.RT-qPCR和Western-Blot分別檢測小鼠心肌組織中纖維化相關(guān)基因(Col1a1，Col3a1，α-SMA)的mRNA和蛋白表達(dá)水平;6.用miRNAs表達(dá)譜芯片檢測Ang-Ⅱ灌注小鼠心肌中miRNAs的表達(dá)譜，RT-qPCR驗(yàn)

4、證小鼠心肌中差異表達(dá)的miRNAs。
　　結(jié)果:1.與生理鹽水(Saline)組相比，Ang-Ⅱ灌注組小鼠收縮壓明顯升高，心臟重量與脛骨長度比值(HW/TL)明顯高于對(duì)照組。2.動(dòng)物心臟B超結(jié)果顯示，與saline組比較，Ang-Ⅱ灌注組小鼠室間隔和心室壁厚度增加，左室容積變小，而反映心功能的射血分?jǐn)?shù)(EF)和左室短軸縮率(FS)均顯著增加。3.Masson三色染色的結(jié)果顯示，比較saline組，模型組小鼠心肌組織膠原含量增加，纖

5、維化程度加劇。4.RT-qPCR和Western-Blot的結(jié)果顯示，模型組小鼠心肌中纖維化相關(guān)基因Col1a1，Col3a1，α-SMA的mRNA和蛋白水平顯著上調(diào)。5.miRNAs表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示，與Saline組相比，模型組小鼠心肌中miRNAs表達(dá)異常，經(jīng)RT-qPCR驗(yàn)證，其中明顯下調(diào)的miRNAs有miR-1，-133b，-16，-214，而miR-21表達(dá)顯著上調(diào)，以miR-214在Ang-Ⅱ灌注小鼠心肌組織中下調(diào)最為顯

6、著。
　　結(jié)論:1.與saline組相比，模型組小鼠心肌組織發(fā)生病理性心肌纖維化，說明我們通過Ang-Ⅱ灌注成功建立心肌纖維化動(dòng)物模型。2.miR-214在Ang-Ⅱ灌注誘導(dǎo)的重構(gòu)小鼠心肌中表達(dá)顯著下調(diào)。
　　第二章 miR-214對(duì)小鼠心肌纖維化的影響
　　目的:明確過表達(dá)miR-214對(duì)小鼠心肌纖維化的影響。
　　方法:1.選取SPF級(jí)體重約20～25 g的雄性C57/BL6小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過植入Ang-Ⅱ

7、膠囊滲透泵(1.46 mg/kg/2w)建立心肌纖維化的動(dòng)物模型。模型組和Saline組分別尾靜脈注射20 nmol agomiR-214和agomiR-NC，每組各8只動(dòng)物;2.測量心臟重量與脛骨長度，計(jì)算相應(yīng)比值;3.動(dòng)物心臟B超檢測小鼠心肌結(jié)構(gòu)與心功能相關(guān)指標(biāo);4.采用Masson三色染色對(duì)小鼠心肌組織進(jìn)行膠原纖維的染色觀察。5.Western-Blot檢測小鼠心肌組織中纖維化相關(guān)蛋白(Col1a1，Col3a1，α-SMA)表達(dá)

8、水平。
　　結(jié)果:1.與Saline組相比，模型組小鼠心臟重量與脛骨長度比值(HW/TL)明顯增加。而與agomiR-NC組相比，agomiR-214組HW/TL值顯著降低。2.動(dòng)物B超結(jié)果顯示，比較saline組，模型組小鼠室間隔和心室壁厚度增加，左室容積變小，而反映心功能的射血分?jǐn)?shù)(EF)和左室短軸縮率(FS)均顯著增加。而與agomiR-NC組相比，尾靜脈注射agomiR-214顯著改善Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心肌重構(gòu)和心功能代

9、償性增強(qiáng)效應(yīng)。3.Masson三色染色的結(jié)果顯示，比較saline組，模型組小鼠心肌組織膠原含量增加，纖維化程度加劇。與agomiR-NC組相比，agomiR-214組纖維化程度降低。4.Western-Blot結(jié)果顯示，比較saline組，模型組小鼠心肌組織中纖維化相關(guān)蛋白水平顯著增加。與agomiR-NC組相比，agomiR-214組纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)降低。
　　結(jié)論:過表達(dá)miR-214可減緩Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心肌組織膠原

10、沉積和心肌重構(gòu)，并恢復(fù)心臟功能。
　　第三章 miR-214對(duì)纖維化相關(guān)基因的調(diào)控作用及其靶基因鑒定
　　目的:明確miR-214對(duì)心肌成纖維細(xì)胞中纖維化表型的影響;對(duì)miR-214進(jìn)行靶基因鑒定，并明確上述靶基因是否介導(dǎo)了miR-214對(duì)心肌纖維化的調(diào)控作用。
　　方法:1.原代分離培養(yǎng)4 w C57/BL6小鼠心肌成纖維細(xì)胞，并通過細(xì)胞免疫熒光法檢測P3代心肌成纖維細(xì)胞(CFs)中α-SMA的表達(dá);2.免疫熒光法檢

11、測心肌成纖維細(xì)胞中纖維化相關(guān)蛋白(Col1a1，Col3a1，α-SMA)表達(dá)水平;3.利用pGL3-promoter熒光素酶載體構(gòu)建含miR-214結(jié)合位點(diǎn)的EZH1，EZH2基因3'UTR重組質(zhì)粒以及相應(yīng)的3'UTR結(jié)合位點(diǎn)突變的重組質(zhì)粒，分別與miR-214mimic共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)鑒定EZH1和EZH2是否為miR-214的作用靶點(diǎn);4.通過轉(zhuǎn)染miR-214 mimic在CFs中過表達(dá)miR-2

12、14，RT-q PCR和Western Blot檢測EZH1和EZH2的mRNA和蛋白表達(dá)水平;5.10-5M Ang-Ⅱ處理CFs24h，Western Blot檢測EZH1、EZH2、纖維化相關(guān)基因(Col1a1，Col3a1，α-SMA)水平變化;6.分別將EZH1 siRNA、EZH2siRNA和miR-214 mimic轉(zhuǎn)染CFs，RT-q PCR和Western Blot檢測EZH1、EZH2、纖維化相關(guān)基因（Col1a1，

13、Col3a1，α-SMA）以及PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)水平;7.腺病毒介導(dǎo)在CFs中分別過表達(dá)EZH1和EZH2，Western Blot檢測EZH1、EZH2、纖維化相關(guān)基因(Col1a1，Col3a1，α-SMA)以及PPARγ的表達(dá)水平變化;8.PPARγ siRNA轉(zhuǎn)染CFs，Western Blot檢測纖維化相關(guān)基因(Col1a1，Col3a1，α-SMA)以及PPARγ的表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果:1.P3代心肌成

14、纖維細(xì)胞中有特異的α-SMA表達(dá)，所培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞的純度達(dá)95％以上。2.轉(zhuǎn)染miR-214 mimic后，心肌成纖維細(xì)胞中纖維化相關(guān)蛋白(Col1a1，Col3a1)的表達(dá)顯著降低。3.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示在miR-214 mimic作用下，與對(duì)照組相比，miR-214與EZH1、EZH23'-UTR的結(jié)合能力顯著增加，熒光素酶活性均顯著下降。而轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)突變的重組質(zhì)粒則不能改變熒光素酶活性。4.心肌成纖維細(xì)胞中過表達(dá)miR-

15、214后，EZH1和EZH2的mRNA和蛋白水平均一致性的顯著下調(diào)。5.EZH1和EZH2在Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化細(xì)胞模型中表達(dá)顯著上調(diào)。6.利用siRNAs沉默心肌成纖維細(xì)胞中EZH1和EZH2表達(dá)后，纖維化相關(guān)基因(Col1a1，Col3a1，α-SMA)的mRNA和蛋白表達(dá)水平均被抑制，而PPARγ的表達(dá)顯著增加，這與在心肌成纖維細(xì)胞中過表達(dá)miR-214的作用相一致。7.在心肌成纖維細(xì)胞中過表達(dá)EZH1和EZH2后，纖維化相

16、關(guān)基因(Col1a1，Col3a1，α-SMA)的蛋白水平顯著增加，而PPARγ的表達(dá)顯著降低。8.沉默PPARγ表達(dá)后，心肌成纖維細(xì)胞中纖維化相關(guān)基因(Col1a1，Col3a1，α-SMA)的蛋白水平顯著增加。
　　結(jié)論:1.EZH1和EZH2是miR-214的作用靶基因。2.miR-214通過在轉(zhuǎn)錄水平抑制EZH1和EZH2，使PPARγ表達(dá)增加，進(jìn)而降低心肌成纖維細(xì)胞中纖維化相關(guān)基因的表達(dá)。
　　全文總結(jié):miR-2