Pyroxd2在線粒體的定位及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　Pyroxd2是通過(guò)酵母雙雜交篩選出的與乙肝病毒 X蛋白具有相互作用的蛋白。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí) Pyroxd2在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量低于正常細(xì)胞，并且在癌組織中表達(dá)量也低于癌旁組織。過(guò)表達(dá) Pyroxd2可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制小鼠肝腫瘤發(fā)生，但具體功能機(jī)制尚不清晰。前期課題組證實(shí) Pyroxd2定位于線粒體，但生物信息學(xué)分析顯示 Pyroxd2并沒有典型的線粒體定位信號(hào)肽。作為一個(gè)功能未知蛋白，為了將來(lái)深入探索 Pyroxd2

2、具體生物學(xué)功能，本課題擬對(duì) Pyroxd2在線粒體中的亞定位，Pyroxd2線粒體輸入的分子機(jī)制以及介導(dǎo)Pyroxd2進(jìn)入線粒體的關(guān)鍵氨基酸序列進(jìn)行分析和研究。
　　方法：
　　通過(guò)細(xì)胞免疫熒光，Western blot，CO-IP，BN-PAGE等方法研究了Pyroxd2線粒體亞定位。通過(guò)對(duì)Pyroxd2進(jìn)行氨基酸序列刪除突變，結(jié)合細(xì)胞免疫熒光以及細(xì)胞組分Western blot實(shí)驗(yàn)分析了Pyroxd2進(jìn)入線粒體的關(guān)鍵氨基

3、酸序列。通過(guò)RNA干擾構(gòu)建一系列敲低細(xì)胞系研究了Pyroxd2蛋白在線粒體輸入的相關(guān)分子機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　CO-IP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí) Pyroxd2與線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅳ組分之一的 COX5B互作，通過(guò)線粒體組分分析確認(rèn) Pyroxd2僅存在于線粒體內(nèi)膜和基質(zhì)組分中，BN-PAGE結(jié)果顯示 Pyroxd2存在于線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅳ（complexⅣ）上，表明 Pyroxd2是一個(gè)存在于線粒體呼吸鏈復(fù)合物 IV并與COX5

4、B互作的蛋白；shRNA干擾線粒體外膜通道蛋白 Tom40和線粒體內(nèi)膜通道蛋白 Tim23的表達(dá)均導(dǎo)致 Pyroxd2-EYFP融合蛋白無(wú)法與線粒體標(biāo)志蛋白COX4共定位，同時(shí)，western blot也檢測(cè)到Pyroxd2-3×flag融合蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)組分中，然而，shRNA干擾與線粒體膜間隙定位相關(guān)蛋白 Mia40的表達(dá)并不影響 Pyroxd2-EYFP融合蛋白與 COX4共定位，western blot檢測(cè)Pyroxd

5、2-3×flag融合蛋白也主要存在于線粒體組分中。這些結(jié)果表明 Pyroxd2線粒體輸入依賴于Tom40和Tim23，而與Mia40無(wú)關(guān)，提示Pyroxd2依賴線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶 TOM復(fù)合物與內(nèi)膜轉(zhuǎn)位酶 TIM23復(fù)合物輸入線粒體內(nèi)膜和基質(zhì)組分中，而不定位于外膜和膜間隙；序列刪除突變結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅 Pyroxd2的101-400aa、101-200aa、201-300aa、151-200aa、201-230aa和151-230aa多肽序列分