次氯酸修飾白蛋白誘導(dǎo)糖尿病大鼠足細(xì)胞凋亡的機(jī)制及線粒體靶向肽的保護(hù)作用.pdf

1、目的：本課題采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠作為模型，驗(yàn)證我們的假設(shè):糖尿病環(huán)境中，HOCl-alb通過誘導(dǎo)線粒體功能失常和細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生，激活凋亡信號，誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腎小球基底膜屏障功能受損，最終導(dǎo)致蛋白尿發(fā)生和腎小球硬化。線粒體靶向抗氧化劑SS-31可能通過阻斷線粒體氧化應(yīng)激損傷，抑制HOCl-alb對足細(xì)胞的促凋亡通路，減少足細(xì)胞的丟失和蛋白尿的形成，從而起到預(yù)防或延緩糖尿病腎病進(jìn)展的作用。
　　方法：一.體外制備無內(nèi)

2、毒素HOCl修飾的大鼠血清白蛋白(HOCl-RSA)及其鑒定:
　　采用Witko-Sarsat等介紹的方法。將無內(nèi)毒素的RSA溶液與次氯酸溶液按照1∶140摩爾比混合，室溫放置30分鐘。制備的HOCl-RSA在4℃無內(nèi)毒素磷酸鹽(PBS)緩沖液中透析24小時(shí)，以除去游離的次氯酸。用0.22μm一次性針頭濾器過濾除菌，分裝后4℃保存。將無內(nèi)毒素的RSA溶液與無菌PBS等體積混合，作為對照。試驗(yàn)中所有玻璃器皿均放入180℃烤箱4小時(shí)

3、以去除內(nèi)毒素。
　　采用鱟試驗(yàn)法測定制備的HOCl-RSA內(nèi)毒素含量，并證實(shí)內(nèi)毒素水平低于0.025EU/ml。
　　二.SS肽的合成和進(jìn)入線粒體的鑒定
　　1.SS肽的合成
　　SS肽由杭州中肽公司協(xié)助合成，SS肽氨基酸序列和化學(xué)結(jié)構(gòu)如下:SS-02(Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2, Dmt=2',6'-dimethyltyrosine), SS-31(D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2)。

4、
　　2.線粒體提取
　　取腎組織（皮質(zhì)），按照試劑盒說明書提取線粒體。
　　3.SS肽體外進(jìn)入線粒體的鑒定
　　結(jié)果顯示，SS-02分布于線粒體外膜約20-30％，線粒體內(nèi)膜約50％，線粒體基質(zhì)20-30％。
　　三.糖尿病模型的制備和分組
　　1、模型制備
　　成年雄性SD(SpragueDawley)大鼠，購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，體重180-220g，在恒溫SPF級環(huán)境飼養(yǎng)，自由進(jìn)食

5、及飲水。禁食16小時(shí)后單次腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)60mg/kg（溶于0.01mol/L檸檬酸緩沖液，PH4.5，現(xiàn)配現(xiàn)用），72小時(shí)后剪尾取血，用電子血糖儀測量血糖，血糖值＞16.7mmol/L作為糖尿病(DM)動物模型。
　　2、實(shí)驗(yàn)動物分組
　　3、標(biāo)本留取
　　于分組后進(jìn)行大鼠干預(yù)16周，取標(biāo)本前一天將大鼠放于代謝籠中留取24小時(shí)尿并記錄尿量，離心20分鐘(4℃3000rpm)，分裝后-70℃冰箱凍存。

6、r>　　四.檢測指標(biāo)
　　1.生化指標(biāo)。
　　2.腎皮質(zhì)勻漿、血漿HOCl-alb濃度檢測:采用分光光度法。
　　3.尿8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)定量:應(yīng)用商品化的ELISA試劑盒檢測。
　　4.病理組織學(xué)觀察:腎皮質(zhì)經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋，4μm切片，行PAS及Masson染色。
　　5.足細(xì)胞凋亡的變化:冰凍切片TUNEL熒光標(biāo)記法計(jì)數(shù)凋亡的足細(xì)胞
　　6.Western Blotting檢測

7、相關(guān)蛋白:腎皮質(zhì)勻漿，提取總蛋白，檢測caspase-3，caspase-7，caspase-9，WT-1和PARP-1表達(dá);腎皮質(zhì)勻漿，分別提取線粒體蛋白和胞漿蛋白，檢測Cytochrome C表達(dá)。
　　7.免疫組織化學(xué)計(jì)數(shù)腎小球足細(xì)胞數(shù)目。
　　結(jié)果：一、大鼠物理和生化指標(biāo)變化:
　　1、體重
　　糖尿病組大鼠體重均較正常組對照組①、②下降(①623.72±21.20，②619.23±23.47 vs③24

8、9.62±29.11，④173.35±27.60，⑤310.14±32.75，⑥241.38±27.29，P均＜0.001），注射HOCl-alb及干預(yù)性SS-31治療均對體重?zé)o顯著影響（P＞0.05 vs組③）。
　　2、血糖
　　糖尿病組大鼠血糖均高于正常組對照組①、②（①5.6±0.8，②5.8±1.0 vs③29.78±2.51，④31.46±3.23，⑤32.34±2.76，⑥30.40±2.48，P均＜0.001

9、），證明糖尿病大鼠成模，而注射HOCl-alb及干預(yù)性SS-31治療均對血糖無顯著影響（P＞0.05 vs組③）。
　　3、尿白蛋白排泄量
　　糖尿病組大鼠24小時(shí)尿蛋白定量高于正常對照組①、②（①0.19±0.05，②0.21±0.03，③0.34±0.09，④0.51±0.10，⑤0.27±0.08，⑥0.30±0.11,P＜0.05 vs組①、②），同時(shí)注射HOCl-alb使糖尿病大鼠尿蛋白排泄量增加（③0.34±0.

10、09 vs④0.51±0.10，P＜0.01），SS-31干預(yù)治療則可顯著減輕HOCl-RSA引起的尿蛋白排泄量增加（④0.51±0.10 vs⑤0.27±0.08，⑥0.30±0.11，P＜0.01）。
　　4、肌酐清除率:
　　糖尿病組大鼠肌酐清除率均高于正常組對照組①、②（①6.24±1.09，②6.37±1.22vs③10.61±2.36，④13.95±4.62，⑤7.67±1.84，⑥8.80±2.03，P均＜0.

11、05），注射HOCl-alb使糖尿病大鼠肌酐清除率升高(③10.61±2.36 vs④13.95±4.62，P＜0.05)，SS-31干預(yù)治療則可改善HOCl-alb引起的肌酐清除率升高(④13.95±4.62 vs⑤7.67±1.84,⑥8.80±2.03, P＜0.01)。
　　二、腎組織病理學(xué)改變
　　腎組織經(jīng)Masson染色和PAS染色，光鏡下觀察顯示，正常對照組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)完整，大小均一，基底膜、系膜無增生，腎小

12、管管壁光滑無變性。糖尿病組大鼠腎小球體積增大，腎小球基底膜增厚和系膜輕度增生，腎小管上皮細(xì)胞呈灶性脫落壞死、顆粒樣和空泡樣變性。注射HOCl-RSA組糖尿病大鼠比注射RSA組糖尿病大鼠病理改變更明顯，部分腎小球已階段性硬化，而注射SS-31組糖尿病大鼠的大部分病理改變則被阻斷。
　　三、氧化應(yīng)激指標(biāo)變化:
　　1、血漿HOCl-alb含量
　　2、腎組織勻漿HOCl-alb含量
　　3、尿8-OHdG定量

13、　　四、Cyt C蛋白表達(dá)的變化:
　　應(yīng)用Western Blotting檢測了細(xì)胞色素C的表達(dá)。結(jié)果顯示，與正常對照大鼠相比，糖尿病大鼠胞漿內(nèi)CytC蛋白水平明顯增加（P＜0.015 vs組①、②）;與注射RSA組糖尿病大鼠相比，注射HOCl-RSA組糖尿病大鼠胞漿內(nèi)CytC水平進(jìn)一步增加（P＜0.008 vs組③）;SS-31干預(yù)則可改善HOCl-RSA引起的胞漿內(nèi)CytC水平增加（P＜0.021 vs組④）各組線粒體內(nèi)Cy

14、tC蛋白水平的變化與胞漿內(nèi)CytC蛋白水平的變化相反。
　　五、足細(xì)胞凋亡的變化
　　采用TUNEL熒光標(biāo)記法檢測凋亡的足細(xì)胞。與正常對照組相比，糖尿病大鼠TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目明顯減少（P＜0.028 vs組①、②）;注射HOCl-RSA組糖尿病大鼠TUNEL陽性的足細(xì)胞比注射RSA組糖尿病大鼠顯著增高(p=0.012);線粒體靶向肽SS-31干預(yù)顯著降低了HOCl-RSA誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡(p=0.023)。提示了SS-3

15、1能降低足細(xì)胞氧化應(yīng)激，進(jìn)而減少了足細(xì)胞凋亡。
　　六、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá):
　　在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的信號通路中，caspase-3是caspase級聯(lián)反應(yīng)下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行者。
　　七、足細(xì)胞丟失數(shù)量的變化:
　　為了驗(yàn)證HOCl-alb誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡導(dǎo)致腎小球足細(xì)胞丟失，足細(xì)胞數(shù)目減少，應(yīng)用足細(xì)胞細(xì)胞核特異性抗原WT-1染色腎小球足細(xì)胞來計(jì)數(shù)腎小球足細(xì)胞數(shù)目。每個(gè)腎小球記錄WT-1陽性核染色數(shù)目。每組選取8只

16、大鼠，隨機(jī)選擇50個(gè)腎小球計(jì)算WT-1陽性核數(shù)目，取平均值。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，糖尿病大鼠WT-1陽性細(xì)胞數(shù)目明顯減少（P＜0.030 vs組①、②）;與注射RSA組糖尿病大鼠相比，注射HOCl-RSA組糖尿病大鼠WT-1陽性細(xì)胞數(shù)目進(jìn)一步降低（P＜0.011 vs組③）; SS-31干預(yù)顯著改善了HOCl-RSA誘導(dǎo)的足細(xì)胞丟失（P＜0.009 vs組④）。
　　采用Western Blotting檢測WT-1蛋白的表達(dá)

17、。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，糖尿病大鼠WT-1蛋白水平明顯減少（P＜0.018 vs組①、②）;注射HOCl-RSA組糖尿病大鼠比注射RSA組糖尿病大鼠WT-1蛋白水平進(jìn)一步降低(P＜0.003 vs組③);SS-31干預(yù)顯著改善了HOCl-RSA誘導(dǎo)的WT-1蛋白水平降低(P＜0.007vs組④)。
　　結(jié)論：一、HOCl-alb加重糖尿病大鼠蛋白尿、腎小球高濾過和腎損傷，其機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)體內(nèi)氧化應(yīng)激和線粒體損傷，細(xì)胞色素