玉米冠根和雄穗中microRNA及Argonaute基因表達(dá)的研究.pdf

1、MicroRNAs(miRNAs)是一類在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的小RNA分子。大量研究表明，miRNA在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫中起著重要的作用;miRNA行使其調(diào)控功能需與Argonaute(AGO)蛋白形成沉默復(fù)合體(RISC:RNAinduced Scilencing Complex)，指導(dǎo)AGO蛋白作用于靶基因，因此AGO蛋白是miRNA行使功能的重要因子。研究證明，不同的AGO蛋白結(jié)合不同種類的小RNA，在特定的

2、逆境條件和組織發(fā)育時(shí)期發(fā)揮作用。本研究針對(duì)miRNA在玉米逆境和生長(zhǎng)發(fā)育中所扮演的重要角色，利用高通量測(cè)序和分子生物學(xué)技術(shù)全基因組解析玉米冠根和雄穗中的miRNA表達(dá)，鑒定玉米冠根中淹水脅迫響應(yīng)的miRNA及其靶基因，克隆玉米基因組中編碼AGO蛋白的基因，揭示AGO基因的時(shí)空表達(dá)模式，探討與雄穗發(fā)育相關(guān)的ZmAGO18a的表達(dá)及其調(diào)控分子機(jī)理。本研究取得了以下研究結(jié)果:
　　 1.對(duì)玉米自交系HZ32和MO17的冠根組織中小RN

3、A進(jìn)行了Solexa測(cè)序，得到了高質(zhì)量的序列結(jié)果。在8個(gè)測(cè)序文庫中，鑒定到61個(gè)成熟小RNAs，其中36個(gè)已知的玉米miRNA，25個(gè)新的miRNA。miR528在冠根中的表達(dá)豐度最高。miR156、miR166、miR167和miR168家族成員在冠根中表達(dá)量高，而miR159、miR164、miR167、miR169、miR319和miR396家族在冠根中表達(dá)量低。
　　 2.在HZ32和MO17的冠根中，鑒定到26個(gè)淹水響

4、應(yīng)的miRNAs，包括19個(gè)已知的miRNAs和7個(gè)新的miRNAs，大部分miRNAs在兩個(gè)自交系中對(duì)淹水響應(yīng)的趨勢(shì)是一致的。
　　 3.對(duì)HZ32和MO17冠根組織的降解組文庫測(cè)序，檢測(cè)到27個(gè)miRNA的98個(gè)靶基因，其中大部分為已知miRNA的靶基因，同時(shí)，也檢測(cè)到了一些miRNA新的靶基因，如miR166的靶基因酪氨酸蛋白激酶，miR390的靶基因無機(jī)焦磷酸酶和miR529的靶基因脫水蛋白13。利用QPCR對(duì)miR16

5、7e、miR164e/f、 miR172a、miR393a/b和miR528a及其靶基因進(jìn)行表達(dá)分析，證實(shí)靶基因的表達(dá)與miRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。同時(shí)采用5'-RLM-RACE的方法對(duì)靶基因切割位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，揭示了zma-miRn03/06直接切割的轉(zhuǎn)錄本分別編碼鋅指蛋白，ran GTPase和K-box轉(zhuǎn)錄因子，zma-miR393b切割TIR1-like基因，zma-miR394a切割F-box基因。綜合miRNAs的表達(dá)和降解組數(shù)

6、據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)miR167、miR393和miR172家族成員在調(diào)控玉米冠根發(fā)育及其響應(yīng)淹水脅迫中具有重要作用，建立了miR167、miR393和miR172家族成員介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控模型。
　　 4.基于B73參考基因組序列，生物信息學(xué)方法鑒定了17個(gè)ZmAGO蛋白編碼基因;RACE分析得到了11個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA;系統(tǒng)進(jìn)化分析將玉米17個(gè)ZmAGO蛋白分為五大類。
　　 5.對(duì)ZmAGO蛋白的PIWI結(jié)構(gòu)域氨基酸序列

7、進(jìn)行多序列比對(duì)分析，總結(jié)了PIWI結(jié)構(gòu)域內(nèi)的DDH/H motif類型，發(fā)現(xiàn)ZmAGO1s，ZmAGO2s和ZmAGO10s較為保守。
　　 6.采用半定量RT-PCR和QPCR技術(shù)對(duì)17個(gè)ZmAGO基因在15個(gè)組織器官的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)ZmAGO基因在生殖器官中的表達(dá)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在營(yíng)養(yǎng)器官中的表達(dá)量，并發(fā)現(xiàn)ZmAGO18a和ZmAGO5a在減數(shù)分裂時(shí)期的玉米雄花穗中表達(dá)量高。
　　 7.分析了ZmAGO18基因

8、在不同組織，不同發(fā)育時(shí)期的花藥及其上下位小花中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ZmAGO18a基因在減數(shù)分裂時(shí)期的花藥中表達(dá)量高。mRNA原位雜交和蛋白熒光免疫組化分析證實(shí)ZmAGO18a在減數(shù)分裂時(shí)期花藥的絨氈層和花粉母細(xì)胞中大量表達(dá)。
　　 8.利用高通量測(cè)序的方法，分離了玉米減數(shù)分裂時(shí)期雄穗中的小RNA，鑒定到172個(gè)已知miRNA基因?qū)?yīng)27個(gè)miRNA家族，20個(gè)新的成熟miRNA對(duì)應(yīng)30個(gè)新MIR基因;并通過RIP-seq技術(shù)，將該時(shí)期