大鼠局灶性腦挫傷后Cdk5表達(dá)變化.pdf

1、前言
　　 腦是重要的生命中樞器官,因遭受暴力導(dǎo)致的腦損傷非常常見,隨著建筑業(yè)和交通業(yè)的迅猛發(fā)展,創(chuàng)傷性腦損傷的發(fā)生率逐年升高,已嚴(yán)重威脅人們的生命健康。腦挫傷在臨床外傷中常見,也是在法醫(yī)鑒定工作中遇到最多的損傷類型之一,推斷腦挫傷時間對于刑事案件的偵查及審判具有重要意義,因此關(guān)于腦損傷的形成機制、時間推斷及其程度判斷應(yīng)引起法醫(yī)學(xué)工作者的重視。準(zhǔn)確推斷腦挫傷時間一直是法醫(yī)學(xué)中的難題,至今尚未圓滿解決,因此有必要進(jìn)一步研究腦挫傷后

2、的蛋白分子機理并找出相應(yīng)的指標(biāo),為臨床診治和法醫(yī)鑒定提供理論依據(jù)。Cdk5是神經(jīng)系統(tǒng)重要激酶之一,與其神經(jīng)元特異性激活因子p35結(jié)合后,錨定于細(xì)胞膜和細(xì)胞上,通過磷酸化包括微管相關(guān)蛋白、tau蛋白、神經(jīng)絲蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、信號分子及調(diào)節(jié)蛋白的特異性絲氨酸/蘇氨酸位點,主要參與神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞遷移、軸突導(dǎo)向、胞膜轉(zhuǎn)運、維持微管穩(wěn)定、細(xì)胞骨架調(diào)整、酶的修飾、調(diào)節(jié)鈣離子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及神經(jīng)遞質(zhì)釋放。在病理條件下,如缺血、谷氨酸鹽過量存在等,在鈣依賴

3、性蛋白酶(calpain)的酶切作用下,p35降解為p10和p25,與p25結(jié)合的Cdk5具有更強的激酶活性,定位也發(fā)生變化,此時Cdk5過度激活導(dǎo)致tau蛋白、MAP-2等過度磷酸化,破壞細(xì)胞骨架,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Cdk5的作用貫穿哺乳動物生命始終,含量穩(wěn)定,其蛋白激酶作用活性僅僅局限于神經(jīng)系統(tǒng),而p35是其神經(jīng)元特異性蛋白。有研究發(fā)現(xiàn),大鼠腦缺血再灌注損傷可引起Cdk5的表達(dá)量增加,因此設(shè)想在大鼠腦中度鈍力打擊模型中Cdk5活性可

4、能發(fā)生變化,有必要利用腦損傷模型研究腦挫傷后Cdk5表達(dá)的時間規(guī)律性變化,為腦損傷時間推斷提供參考依據(jù)。
　　 材料與方法
　　 雄性SD大鼠50只,體重220-250g,由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供。隨機分為10組,其中包括8個實驗組,1個正常對照組,1個假手術(shù)組,每組5只大鼠。實驗組采用吳旭等研制的大鼠腦挫傷模型制作方法,制造大鼠局灶性閉合性腦挫傷模型。乙醚吸入預(yù)麻醉,大鼠稱重后,2%戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔

5、注射麻醉。正中切開大鼠頂部頭皮,在人字縫前3mm,矢狀縫旁3mm處鉆直徑為5mm的圓形骨窗,保持硬腦膜完好,采用自由落體打擊裝置,以30g重錘從25cm高處落下,打擊暴露的腦組織;假手術(shù)組以相同的方法鉆孔,但不進(jìn)行打擊。術(shù)后動物分籠飼養(yǎng),保持墊料清潔及空氣通暢。分別于傷后3h、6h、12h、24h、3d、3d、5d、10d將大鼠乙醚麻醉后脫頸椎處死。手術(shù)取出腦組織,沿冠狀方向?qū)⒋靷麉^(qū)平均分為兩部分,并對損傷周邊區(qū)進(jìn)行取材、修塊,一份用于

6、免疫組化染色,另一份用于Western blot檢測。對照組和假手術(shù)組以同樣方法取相同部位的腦組織作為對照。
　　 腦組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后,水洗,梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,制作50μm厚度切片。采用鏈霉素.生物素法(SP法)進(jìn)行免疫組化染色,并用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核,具體步驟按照試劑盒說明書。Cdk5多克隆一抗(1:400)稀釋,4℃孵育過夜。染色過程中另以一抗稀釋液替代一抗,作為陰性對照。兔來源Cdk5(C-8)購自

7、Santa Cruz Biotechnology,兔SP免疫組織化學(xué)試劑盒(SP-9001)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。
　　 對用于Western blot的腦組織進(jìn)行裂解、勻漿、離心、提取蛋白并進(jìn)行蛋白定量,聚丙烯酰胺凝膠電泳,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印,5%脫脂牛奶封閉,一抗(1:400稀釋)、二抗(1:2000稀釋)孵育后,DAB顯色。實驗中以β-actin為內(nèi)參。
　　 實驗結(jié)果
　　 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果:對照

8、組及假手術(shù)組神經(jīng)元胞漿中可見少量Cdk5蛋白表達(dá),陽性染色較淡。實驗組中,腦挫傷后3h、6h組挫傷周邊區(qū)可見陽性細(xì)胞數(shù)逐漸增多,胞漿內(nèi)Cdk5蛋白表達(dá)增多,陽性染色較深;6h、12h組陽性細(xì)胞數(shù)維持在較高水平,傷后24h組陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)到高峰,隨后3d、5d組可見陽性細(xì)胞數(shù)維持較高水平,7d、10d組基本降至基礎(chǔ)水平,并可見陽性細(xì)胞染色較淡。
　　 Western blot結(jié)果:對照組和假手術(shù)組可見少量Cdk5表達(dá);腦挫傷后3h、

9、6h組可見Cdk5蛋白表達(dá)增加,6h、12h組Cdk5表達(dá)維持較高水平;24h組達(dá)到高峰,隨后3d組、5d組維持在較高水平,7d、10d組降至基礎(chǔ)水平。取損傷后不同時間段條帶的平均光密度值,經(jīng)統(tǒng)計分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論
　　 本實驗在建立大鼠局灶性閉合性腦挫傷模型的基礎(chǔ)上,應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、Western blot方法檢測大鼠腦挫傷后Cdk5表達(dá),結(jié)果表明:
　　 1.正常大鼠腦