大鼠腦挫傷后低氧誘導因子-1α的表達與挫傷經(jīng)過時間的推斷.pdf

1、目的：應用免疫組化SABC法、免疫印跡Western Bloting法和實時熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測大鼠腦挫傷后HIF-1α蛋白和HIF-1αmRNA的時序性表達規(guī)律，探討HIF-1α推斷腦挫傷的可行性，旨在為法醫(yī)實踐中推斷腦挫傷經(jīng)過時間提供依據(jù)。
　　 方法：選取健康成年SD大鼠64只，隨機分為對照組和實驗組，每組8只。參照Feeney法建立大鼠閉合性腦挫傷模型，實驗組按損傷時間不同分為傷后1h、6h、12h、48h、72

2、h、7d、14d共7組，對照組動物僅切開頭皮，右頂開骨窗，不致腦損傷，在損傷后依規(guī)定時間內(nèi)處死動物，對照組動物于鉆孔后1h處死，取出腦組織，以腦挫傷灶為中心旁開1mm行大鼠腦冠狀切面取材，置于4％多聚甲醛PBS液中固定，用于免疫組織化學染色；于腦挫傷灶取腦組織-80℃液氮保存用于蛋白和總RNA的提取。應用免疫組化SABC法和免疫印跡Western Bloting法檢測各組HIF-1α蛋白的表達，利用圖像分析技術(shù)定量測定免疫組化染色切片的

3、陽性細胞數(shù)及以條帶積分光密度值，所得數(shù)據(jù)用用SPSS13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。將提取的腦組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，采用實時熒光定量PCR檢測HIF-1αmRNA轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈的相對表達量，所得數(shù)據(jù)用用SPSS13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。
　　 結(jié)果：(1)HE結(jié)果：對照組神經(jīng)元細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，核染色較淡、圓形，核仁清楚。損傷組可見腦實質(zhì)散在出血，蛛網(wǎng)膜下腔、側(cè)腦室出血。所選切

4、面各部位均可見程度不一的神經(jīng)元細胞核深染、固縮，神經(jīng)元細胞水腫，周圍出現(xiàn)空隙，逐漸發(fā)展為胞核破碎溶解，神經(jīng)元壞死消失，周圍膠質(zhì)細胞增生；(2)免疫組織組化學SABC法染色結(jié)果：對照組神經(jīng)細胞偶見HIF-1α表達，陽性產(chǎn)物呈棕黃色，主要位于神經(jīng)細胞胞核及胞漿內(nèi)；傷后1h挫傷灶周圍即可觀察到陽性反應細胞，呈散在少量分布；傷后12h可見表達HIF-1α的神經(jīng)細胞數(shù)增多，表達強度增強，差異有顯著性(P＜0.05)；48h后達高峰，陽性細胞聚集成

5、簇，周圍可見大量棕黃色產(chǎn)物。隨后陽性反應細胞逐漸減少，7d后仍見少量表達，14d后基本恢復正常；(3)免疫印跡Western Bloting結(jié)果：腦挫傷后1h即可見條帶，12h時條帶明顯增寬，48h的條帶最寬，隨后開始減少，到14d時條帶幾乎不可見。除14d組外，各實驗組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；實驗組間兩兩比較，除12h組和72h組之間無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)外，其余各組間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；

6、(4)實時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果：HIF-1αmRNA于腦挫傷后1h表達顯著增強(P＜0.01)，達到高峰，為正常組的75.58倍，隨后逐漸下降，至48h時又出現(xiàn)一次高峰，隨后又開始下降，14d時降至正常水平。
　　 結(jié)論：大鼠腦挫傷后腦組織中HIF-1α蛋白和HIF-1αmRNA的表達隨著損傷時間的延長都呈時序性規(guī)律變化，但變化規(guī)律有所不同，HIF-1αmRNA的表達高峰出現(xiàn)較早，可用于較早損傷時間的推斷，兩者綜合分析，