大鼠腦挫傷后基質(zhì)金屬蛋白酶3表達(dá)變化的研究.pdf

1、前言: 腦挫傷是法醫(yī)學(xué)工作中常見(jiàn)的損傷類型，推斷腦挫傷時(shí)間對(duì)刑事案件的偵查及審判具有重要意義，然而準(zhǔn)確推斷腦挫傷時(shí)間一直是法醫(yī)學(xué)中的難題，至今尚未圓滿解決。基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，參與組織形態(tài)發(fā)生、損傷修復(fù)、炎癥反應(yīng)等一系列的生理、病理過(guò)程，在腦挫傷修復(fù)過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠腦挫傷模型，研究基質(zhì)金屬蛋白酶3在腦挫傷修復(fù)過(guò)程中的表達(dá)變化規(guī)律，以期為法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中準(zhǔn)確推斷腦挫

2、傷時(shí)間提供一種新的方法。 材料與方法: 一、動(dòng)物模型的制作分組與對(duì)照 雄性SD大鼠50只，體重在200-250g之間，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。隨機(jī)分為10組，每組5只，其中8組為實(shí)驗(yàn)組，1組為對(duì)照組，1組為假手術(shù)組。實(shí)驗(yàn)組采用吳旭等研制的大鼠腦挫傷模型制作方法，制造大鼠腦挫傷模型。大鼠稱重后，乙醚吸入預(yù)麻醉，2％戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉。正中切開(kāi)大鼠頂部頭皮，在人字縫前3mm，矢狀縫旁3mm

3、處鉆直徑為5mm的圓形骨窗，保持硬腦膜完好。采用自由落體打擊裝置，以30g重錘從25cm高處落下，打擊暴露的腦組織。術(shù)后動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，保持墊料清潔及空氣通暢。于傷后6h、12h、24h、3d、5d、7d、10d、14d將大鼠麻醉后脫頸椎處死，手術(shù)取出腦組織，沿冠狀方向?qū)⒋靷麉^(qū)平均分為兩部分，一份用于免疫組化染色，另一份用于Western blot檢測(cè)。假手術(shù)組僅行顱骨鉆孔。對(duì)照組及假手術(shù)組，以同樣方法取相同部位的腦組織作為對(duì)照。

4、 二、免疫組織化學(xué)染色 腦組織經(jīng)4％多聚甲醛固定后，水洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制作5μm厚度切片。采用鏈霉素-生物素法(SP法)進(jìn)行免疫組化染色，并用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，具體步驟同試劑盒說(shuō)明書(shū)。MMP-3抗體1：400稀釋，4℃孵育過(guò)夜。染色過(guò)程中另以PBS替代一抗，作為陰性對(duì)照。同時(shí)進(jìn)行常規(guī)H.E.染色。山羊抗大鼠MMP-3多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，SP免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)

5、有限公司。 三、Western blot檢測(cè) 提取腦組織蛋白并進(jìn)行蛋白定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)印，5％脫脂牛奶封閉，一抗(1：1000稀釋)、二抗(1：2500稀釋)孵育后，ECL顯色。實(shí)驗(yàn)中以GAPDH為內(nèi)參。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 一、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 對(duì)照組及假手術(shù)組腦組織未見(jiàn)MMP-3陽(yáng)性染色。實(shí)驗(yàn)組中，傷后6h組腦組織開(kāi)始出現(xiàn)陽(yáng)性染色，胞漿著色，程度較弱，陽(yáng)性細(xì)胞主要為神經(jīng)元，12h組

6、染色程度增強(qiáng)。傷后24h組表達(dá)MMP-3的神經(jīng)元顯著增多，并可見(jiàn)少量膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)MMP-3陽(yáng)性。3d組MMP-3陽(yáng)性染色進(jìn)一步增強(qiáng)，傷后5d組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度都達(dá)到高峰，呈深棕黃色，彌漫分布于神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿和胞核中。傷后7d組MMP-3陽(yáng)性染色開(kāi)始減弱，10d組陽(yáng)性細(xì)胞減少，至傷后14d仍有少量MMP-3表達(dá)。使用Motic Images Advanced 3.2軟件對(duì)各組MMP-3免疫組化染色陽(yáng)性反應(yīng)物進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)

7、果顯示，陽(yáng)性反應(yīng)物面積百分比及陽(yáng)性反應(yīng)物平均光密度值差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 二、Western blot結(jié)果 對(duì)照組及假手術(shù)組腦組織未見(jiàn)MMP-3表達(dá)，挫傷后6h開(kāi)始出現(xiàn)MMP-3表達(dá)，隨后表達(dá)量逐漸上升，5d達(dá)到高峰，以后逐漸下降，14d時(shí)仍有表達(dá)。應(yīng)用Fluorchem V 2.0 Stand Alone軟件獲取感光條帶的平均灰度值，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論: 本實(shí)驗(yàn)在建立大鼠腦挫傷模型的