大鼠邊緣下區(qū)Cdk5及突觸結(jié)構(gòu)在條件性恐懼消退訓(xùn)練后的變化研究.pdf

1、近些年,各種災(zāi)難頻繁發(fā)生,創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder,PTSD)的發(fā)病率有增加的趨勢(shì),并且目前對(duì)PTSD發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)還不夠深入,導(dǎo)致其治療存在許多困難,因此PTSD也成為科學(xué)家研究的熱點(diǎn)。臨床上,治療PTSD的常用方法是暴露療法,即對(duì)創(chuàng)傷記憶進(jìn)行消退,但已消退的恐懼記憶又容易再現(xiàn),提示消退記憶保持障礙可能是PTSD發(fā)生和治療困難的關(guān)鍵。以往的研究表明,前額葉皮層(prefrontal

2、cortex,PFC)的功能狀態(tài)與PTSD的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。嚙齒類(lèi)動(dòng)物PFC的邊緣下皮層(infralimbic cortex,IL)則是消退記憶保持的重要部位,然而,關(guān)于該區(qū)在消退記憶中的分子機(jī)制尚不完全清楚。
　　 許多研究顯示,細(xì)胞周期素依賴(lài)性蛋白激酶5(Cyclin-dependent kinase5,Cdk5)及其激活劑P35廣泛存在于大腦皮層,Cdk5/P35復(fù)合物可改變海馬中突觸的功能和結(jié)構(gòu)可塑性,并影響條件性

3、恐懼記憶的形成以及消退記憶的習(xí)得。但是,在條件性恐懼消退訓(xùn)練后,大鼠IL區(qū)Cdk5和P35的蛋白表達(dá)以及激酶活性如何變化?這個(gè)過(guò)程中IL區(qū)的突觸結(jié)構(gòu)又會(huì)發(fā)生怎樣的變化?這些均未見(jiàn)報(bào)道。為此,我們?cè)O(shè)計(jì)了以下兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。
　　 實(shí)驗(yàn)一、條件性恐懼消退訓(xùn)練后大鼠邊緣下區(qū)Cdk5的表達(dá)和酶活性的變化
　　 目的:探討在條件性恐懼消退訓(xùn)練后,大鼠IL區(qū)Cdk5表達(dá)和活性的變化。方法:將雄性SD大鼠隨機(jī)分為消退組、消退對(duì)照組和正常對(duì)照

4、組。采用聲音結(jié)合足底電擊的方式建立條件性恐懼模型,消退組在恐懼建立后24h進(jìn)行消退訓(xùn)練,消退對(duì)照組不進(jìn)行消退訓(xùn)練,兩組均在不同時(shí)間點(diǎn)(恐懼建立后第2、4和8天)進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試后,使用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠IL區(qū)Cdk5的免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、Western blot檢測(cè)Cdk5及其激活劑P35、P25的蛋白表達(dá)水平以及液閃法檢測(cè)Cdk5活性的變化。
　　 結(jié)果:(1)消退組和消退對(duì)照組的不僵立時(shí)間百分比在恐懼建立后第2天和第4

5、天均顯著低于正常組(86.03±8.90,P＜0.01);到恐懼建立后第8天,消退組基本恢復(fù)正常,而消退對(duì)照組(36.18±12.60)仍低于正常組(P＜0.01)。同組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的比較:隨時(shí)間進(jìn)展,兩實(shí)驗(yàn)組的恐懼水平均呈逐漸下降的趨勢(shì)(P＜0.01)。
　　 (2)免疫組化結(jié)果顯示:在恐懼建立后第2天,消退組大鼠IL區(qū)Cdk5的免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與正常組無(wú)差異,消退對(duì)照組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(429±70)卻多于正常組(322±52

6、,P=0.026)和消退組(358±63,P＜0.05);在恐懼建立后第4天,消退組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少(208±30,P＜0.01),消退對(duì)照組基本恢復(fù)正常;在恐懼建立后第8天,消退組也恢復(fù)正常,與消退對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 (3)Western blot的結(jié)果為:在消退訓(xùn)練后1周內(nèi),消退組大鼠IL區(qū)Cdk5的蛋白表達(dá)呈減少的趨勢(shì):消退后第1和3天的表達(dá)與正常組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而到消退后第7天(1.35±0.13)少于

7、正常組(1.89±0.06,P＜0.05);消退對(duì)照組的Cdk5蛋白表達(dá)在恐懼建立后第4天增多(2.94±0.19),明顯高于消退組(1.78±0.20,P＜0.01)和正常組(P＜0.01);到恐懼建立后第8天基本恢復(fù)正常,但顯著多于消退組(P＜0.01)。
　　 兩組P35的表達(dá)與正常組無(wú)顯著性差異:而兩組P25的蛋白表達(dá)均顯著高于正常組。在消退訓(xùn)練后1周,消退組P25的表達(dá)逐漸減少:消退后第7天(1.60±0.12)明顯低

8、于消退后第1天(2.14±0.24,P=0.032)和第3天(2.17±0.21,P=0.026);消退對(duì)照組在這個(gè)過(guò)程中則有增加的趨勢(shì):恐懼建立后第2天的表達(dá)(1.78±0.16)明顯少于恐懼建立后第4天(2.50±0.19,P=0.039)和第8天(2.58±0.40,P=0.027)。
　　 (4)液閃法的結(jié)果為:消退組大鼠IL區(qū)Cdk5的活性在消退訓(xùn)練后第1和3天顯著增加(產(chǎn)物的放射性活度值分別為3107.78±536.

9、42和3330.05±597.82,P＜0.01),但到消退后第7天(2179.89±327.20)基本恢復(fù)到正常水平(1812.08±175.21);而消退對(duì)照組在這三天均明顯高于正常組(P＜0.05或P＜0.01)。兩實(shí)驗(yàn)組比較顯示,在恐懼建立后第2天無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,消退組的激酶活性在恐懼建立后第4和第8天都顯著低于消退對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 結(jié)論:條件性恐懼使IL區(qū)Cdk5的蛋白表達(dá)和活性升高,大鼠的僵

10、立行為較多;而經(jīng)過(guò)消退訓(xùn)練后,Cdk5的蛋白表達(dá)逐漸降低、活性較快恢復(fù)正常,大鼠的恐懼反應(yīng)也逐漸減少,這些變化可能有利于消退記憶的保持。
　　 實(shí)驗(yàn)二、條件性恐懼消退訓(xùn)練后大鼠邊緣下區(qū)突觸數(shù)密度及突觸界面結(jié)構(gòu)的變化
　　 目的:探討條件性恐懼消退訓(xùn)練后,大鼠IL區(qū)突觸數(shù)密度和突觸界面結(jié)構(gòu)的變化。
　　 方法:將雄性SD大鼠隨機(jī)分為消退組、消退對(duì)照組和正常對(duì)照組。采用聲音結(jié)合足底電擊的方式建立條件性恐懼模型,消退組

11、在恐懼建立后24h進(jìn)行消退訓(xùn)練,消退對(duì)照組不進(jìn)行消退訓(xùn)練,兩組均在不同時(shí)間點(diǎn)(恐懼建立后第8和22天)測(cè)定大鼠的僵立行為,然后快速斷頭取IL區(qū)按常規(guī)方法制作透射電鏡標(biāo)本,并用透射電鏡觀察、攝像,分析該區(qū)突觸數(shù)密度和突觸界面結(jié)構(gòu)參數(shù),包括:突觸界面曲率、活性區(qū)長(zhǎng)度、突觸間隙寬度和突觸后致密物質(zhì)(postsynaptic density,PSD)厚度的變化。
　　 結(jié)果:(1)行為學(xué):消退組大鼠在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的保持成績(jī)均與正常組(91

12、.17±3.07)無(wú)顯著差異;消退對(duì)照組在恐懼建立后第22天(66.73±8.75)的不僵立時(shí)間多于第8天(38.40±10.12,P=0.021),卻都明顯少于正常組(P＜0.01)和消退組(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 (2)突觸數(shù)密度:在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),消退組大鼠IL區(qū)的突觸數(shù)密度(單位體積下的突觸數(shù)量)均明顯高于正常組(0.36±0.06,P＜0.05);而消退對(duì)照組在恐懼建立后第8天的突觸數(shù)密度(0.39±0.04

13、)與正常無(wú)差異,但在恐懼建立后第22天(0.22±0.03)明顯低于正常組(P=0.038)和消退組(0.48±0.06,P＜0.01)。
　　 (3)突觸界面參數(shù):三組間比較顯示,突觸界面曲率和突觸間隙無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而活性區(qū)長(zhǎng)度和PSD厚度有顯著性差異。與正常組相比,在消退訓(xùn)練后第7天,消退組大鼠IL區(qū)的PSD厚度無(wú)明顯變化,到消退后第21天,PSD厚度增加(53.87±11.39,P=0.017);消退對(duì)照組則在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均

14、表現(xiàn)為PSD的厚度變薄(P＜0.05或P＜0.01),且突觸活性區(qū)長(zhǎng)度均小于消退組(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 結(jié)論:條件性恐懼的建立使IL區(qū)的突觸數(shù)密度減少,突觸的結(jié)構(gòu)受到損害,而消退訓(xùn)練后,該區(qū)的突觸數(shù)密度增加,突觸傳遞效率增強(qiáng),有利于條件性恐懼反應(yīng)的減少。
　　 總之,從這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)可以推測(cè):條件性恐懼消退訓(xùn)練后,IL區(qū)Cdk5的改變與IL區(qū)突觸結(jié)構(gòu)可塑性的變化存在一定的聯(lián)系,即條件性恐懼建立后,大鼠IL區(qū)