局灶性腦缺血大鼠腦組織NgR的表達(dá).pdf

1、腦缺血(cerebral ischemia)有局灶性和彌漫性腦缺血、永久性和暫時(shí)性腦缺血之分，且均伴有不同程度神經(jīng)元死亡，或功能缺損。研究證明中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)再生障礙是腦和脊髓永久性損傷的主要原因。在對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子的研究中，人們分離出了多種抑制神經(jīng)再生的分子，其中包含髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)、Nogo和少突膠質(zhì)細(xì)胞/髓鞘糖蛋白。這三種神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子在抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生方面起著相當(dāng)重要的作用。
　　 NgR是在20

2、01年由Fournier等運(yùn)用堿性磷酸酶融合技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)的一種介導(dǎo)中樞神經(jīng)再生抑制作用的受體。由于NgR可以同時(shí)介導(dǎo)髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)、Nogo和少突膠質(zhì)細(xì)胞/髓鞘糖蛋白(OMgp)三種抑制因子的抑制作用而成為神經(jīng)系統(tǒng)再生研究中的熱點(diǎn)內(nèi)容。NgR被發(fā)現(xiàn)后至今已經(jīng)有很多實(shí)驗(yàn)室開始對(duì)其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的分布進(jìn)行研究，例如研究證明，正常成年大鼠中，NgR在灰質(zhì)中含量較高，大腦皮層、海馬、腦橋、小腦蒲肯野細(xì)胞也有分布，不表達(dá)于少突膠質(zhì)細(xì)胞

3、表面、髓鞘膜面，但在被髓鞘包裹的軸突表面能夠檢測(cè)。外周組織中，只有心臟和腎臟有極少量的分布。NgR在老年大鼠腦組織中的表達(dá)分布情況為：大腦皮質(zhì)可見散在分布的中等強(qiáng)度以上陽(yáng)性神經(jīng)元及神經(jīng)纖維，第Ⅱ?qū)佑袕?qiáng)陽(yáng)性錐體細(xì)胞分布，海馬CA1～CA3的錐體細(xì)胞層、齒狀回顆粒層可見強(qiáng)陽(yáng)性神經(jīng)元，胞漿及突起均著色并有棕黃色顆粒狀結(jié)構(gòu)沉積于胞膜。另外還有實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，NgR表達(dá)高峰在30天慢性腦缺血模型組而后下降；腦內(nèi)NgR蛋白和NgRmRNA的表達(dá)水平在

4、DAI后明顯下降，在傷后72小時(shí)降到最低，此后逐漸恢復(fù)，到第7天基本恢復(fù)傷前水平。大腦皮層、海馬、下丘腦等處有很強(qiáng)的免疫陽(yáng)性反應(yīng)等等。到目前為止，NgR在神經(jīng)系統(tǒng)分布方面的研究已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但不足之處就是，針對(duì)所選模型的NgR區(qū)域分布研究不夠詳細(xì)，觀察時(shí)間點(diǎn)間隔太長(zhǎng)。不能夠更系統(tǒng)的，更確切的反映NgR的區(qū)域性分布及隨時(shí)間變化的總體趨勢(shì)。
　　 目的：
　　 研究局灶性腦缺血大鼠腦組織NgR的區(qū)域性表達(dá)，及隨缺血時(shí)

5、間的延長(zhǎng)其表達(dá)的變化規(guī)律。
　　 方法：
　　 1.造模：通過(guò)大腦中動(dòng)脈電凝術(shù)(MCAO)電凝手術(shù)組SD大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈建立大鼠局灶性腦缺血模型；假手術(shù)組進(jìn)行同樣的處理但不凝閉大腦中動(dòng)脈；正常組不做任何處理。
　　 2.行為學(xué)檢測(cè)：用Bederson法對(duì)正常組、手術(shù)組和假手術(shù)組進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，符合要求的SD大鼠才可用于正式實(shí)驗(yàn)。
　　 3.TTC染色及實(shí)驗(yàn)分組：MCAO術(shù)后24小時(shí)，從被選入正式試驗(yàn)的

6、正常組、手術(shù)組和假手術(shù)組中各隨機(jī)選取一只SD大鼠迅速斷頸取腦進(jìn)行TTC染色，觀察梗死灶的大小。TTC染色后剩余的正常組、手術(shù)組和假手術(shù)組SD大鼠再隨機(jī)分為1天組、2天組、3天組、5天組、7天組、14天組、28天組和56天組8個(gè)亞組。
　　 4.取材：在術(shù)后1天、2天、3天、5天、7天、14天、28天和56天灌注固定各亞組的SD大鼠，取腦組織進(jìn)行冰凍切片。每個(gè)腦組織取前囟+1.60mm和-3.30mm兩個(gè)冠狀截面，每個(gè)截面切取三張

7、切片。
　　 5.焦油紫染色及免疫組織化學(xué)：焦油紫染色觀察腦組織缺血情況及隨缺血時(shí)間的延長(zhǎng)皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)及海馬(CA1、CA2和CA3)神經(jīng)元數(shù)目變化趨勢(shì)；免疫組織化學(xué)檢測(cè)NgR及GFAP在MCAO術(shù)后不同腦組織區(qū)域，以及不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.術(shù)后1天正常組及假手術(shù)組均無(wú)任何癥狀；手術(shù)組出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)病學(xué)改變：神經(jīng)功能評(píng)分Ⅰ級(jí)者約占55.1％，Ⅱ級(jí)者約占34.7％，Ⅲ級(jí)者約占10.2％。

8、r>　　 2.TTC染色可以看到缺血中心區(qū)為白色，正常腦組織呈現(xiàn)紅色。
　　 3.皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)及海馬(CA1、CA2和CA3)神經(jīng)元計(jì)數(shù)：
　　 (1)焦油紫染色可以看到在梗死灶內(nèi)絕大多數(shù)神經(jīng)元已經(jīng)死亡，正常細(xì)胞數(shù)目極少，更多的是壞死變形的神經(jīng)元或神經(jīng)元碎片。缺血半暗區(qū)神經(jīng)元腫脹，體積增大，形狀改變，半暗區(qū)神經(jīng)元數(shù)目較正常區(qū)為少，部分細(xì)胞腫脹，胞核呈不規(guī)則形。
　　 (2)MCAO術(shù)后各組缺血側(cè)和健側(cè)皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)神

9、經(jīng)元計(jì)數(shù)結(jié)果與正常組和假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。正常組與假手術(shù)組缺血側(cè)和健側(cè)神經(jīng)元計(jì)數(shù)結(jié)果分別為142.39±3.99、144.24±4.11；140.71±3.95、141.67±4.24。
　　 (3)MCAO術(shù)后缺血側(cè)和健側(cè)海馬CA1、CA2及CA3區(qū)神經(jīng)元計(jì)數(shù)最低值均出現(xiàn)在術(shù)后第5天，各組神經(jīng)元計(jì)數(shù)與正常組和假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.缺血腦組織NgR的表達(dá)：

10、r>　　 (1)MCAO術(shù)后皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)NgR陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)：缺血側(cè)和健側(cè)第二高峰均出現(xiàn)在術(shù)后第28天，最低值均出現(xiàn)在術(shù)后第5天；第一高峰出現(xiàn)的時(shí)間有所不同，缺血側(cè)出現(xiàn)在術(shù)后第3天，健側(cè)出現(xiàn)在術(shù)后第1天。術(shù)后1天組健側(cè)、3天組缺血側(cè)、及5天和28天組缺血側(cè)和健側(cè)NgR陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果與正常組和假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (2)MCAO術(shù)后缺血側(cè)及健側(cè)海馬CA1、CA2和CA3區(qū)NgR陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)第二高峰均

11、出現(xiàn)在術(shù)后第28天，最低值均出現(xiàn)在術(shù)后第5天；第一高峰出現(xiàn)的時(shí)間海馬CA1及CA2區(qū)的健側(cè)及缺血側(cè)均相同，為術(shù)后第1天，A3區(qū)健側(cè)及缺血側(cè)的第一高峰則出現(xiàn)在術(shù)后第2天。CA1和CA2區(qū)1天組，各組NgR陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)與正常組和假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (3)MCAO術(shù)后健側(cè)大腦皮層其他各區(qū)及紋狀體NgR陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。MCAO術(shù)后健側(cè)Cg1/Cg2、GI/DI、S1/S2、Pir、AuD/Aul/AuV、

12、RSGb/RSA和CpuNgR陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律，但總體上仍具有一定的相似性：第一峰值出現(xiàn)在術(shù)后第1天，第二峰值出現(xiàn)在術(shù)后第28天，最低值均出現(xiàn)在術(shù)后第5天。MCAO術(shù)后1天、5天和28天健側(cè)Cg1/Cg2、GI/DI、S1/S2、Pir、AuD/Aul/AuV、RSGb/RSA和CpuNgR陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果與正常組和假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 5.皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)及海馬(CA1、CA2和CA3

13、)GFAP的表達(dá)：
　　 (1)MCAO術(shù)后皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)：缺血側(cè)和健側(cè)最高值出現(xiàn)時(shí)間不同，分別為術(shù)后第7天和第5天；缺血側(cè)和健側(cè)最低值出現(xiàn)在術(shù)后第1天，并均在術(shù)后第14天出現(xiàn)第二個(gè)低谷。術(shù)后1天組缺血側(cè)和健側(cè)，5天組健側(cè)，7天組缺血側(cè)，14天組缺血側(cè)和健側(cè)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果分別為：10.35±2.00、8.85±1.58；75.29±2.86；85.61±3.32；16.58±1.98、15.70±2.4

14、0。以上各組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)與正常組和假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (2)MCAO術(shù)后GFAP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)缺血側(cè)和健側(cè)最高值均出現(xiàn)在術(shù)后第7天；CA2區(qū)缺血側(cè)最高值出現(xiàn)在術(shù)后第5天，健側(cè)出現(xiàn)在第7天；CA3區(qū)缺血側(cè)和健側(cè)最高值均出現(xiàn)在術(shù)后第5天。術(shù)后CA1區(qū)7天組缺血側(cè)和健側(cè)，CA2區(qū)5天組缺血側(cè)，CA2區(qū)7天組健側(cè)，CA3區(qū)5天組缺血側(cè)和健側(cè)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果與正常組和假手術(shù)組比較

15、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.MCAO術(shù)后，皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)神經(jīng)元數(shù)目與正常組比較無(wú)明顯變化；海馬(CA1、CA2和CA3)神經(jīng)元數(shù)目在第5天出現(xiàn)低谷，隨后逐漸升高但仍低于正常組。
　　 2.局灶性腦缺血大鼠腦組織中NgR的表達(dá)：
　　 (1)局灶性腦缺血大鼠腦組織NgR的區(qū)域性表達(dá)。同一時(shí)間點(diǎn)，同一冠狀腦組織切片中，NgR在缺血側(cè)的表達(dá)總體上來(lái)說(shuō)要高于健側(cè)；大腦皮層和海馬(CA1、

16、CA2和CA3)NgR表達(dá)量最高，紋狀體次之。
　　 (2)隨缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，局灶性腦缺血大鼠腦組織NgR表達(dá)變化規(guī)律。從同一區(qū)域不同時(shí)間點(diǎn)來(lái)看，NgR表達(dá)在不同的區(qū)域有不同的變化特點(diǎn)，但在總體變化趨勢(shì)上呈現(xiàn)出兩峰一低谷的現(xiàn)象。第一個(gè)高峰出現(xiàn)的時(shí)間因區(qū)域的不同而異，但大都集中在1到3天；術(shù)后第5天出現(xiàn)全腦NgR表達(dá)低谷；術(shù)后第28天出現(xiàn)全腦NgR表達(dá)的第二個(gè)高峰。
　　 3.MCAO術(shù)后，皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)及海馬(CA1、CA2