微管蛋白抑制劑SUD包合物脂質(zhì)體的制備及其初步藥效學和藥動學研究.pdf

1、目的：環(huán)糊精和脂質(zhì)體(1iposomes)作為藥物的載體，可有效地提高藥物的生物利用度和治療指數(shù)。脂質(zhì)體是一種具有類生物膜結(jié)構(gòu)的雙分子層微囊，是一種定向藥物載體，屬于靶向給藥體系(targeting drug deliverysystem)的一種新型給藥系統(tǒng)。其進入體內(nèi)后主要被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬而激活機體的自身免疫功能，并且通過改變被包封藥物的體內(nèi)分布，使藥物主要在肝、脾、肺等組織器官中蓄積，并能優(yōu)先聚集于腫瘤、炎癥、感染等部位，從而提高

2、藥物治療指數(shù)，減少治療劑量并降低藥物的毒性；但脂質(zhì)體在包埋藥物尤其是疏水性藥物時往往受到藥脂比等因素的限制，并且某些疏水性藥物可能會干擾脂質(zhì)雙層的結(jié)構(gòu)，影響脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，使其在貯存過程發(fā)生藥物泄漏。脂質(zhì)體包封疏水性藥物存在的這些問題在一定程度上限制了它的應用。環(huán)糊精(cyclodextrins，CYD)的特殊結(jié)構(gòu)使其可與和疏水性藥物形成包合物，增加難溶性藥物的溶解度，提高其生物利用度。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，利用環(huán)糊精與脂質(zhì)體各自具備的優(yōu)點

3、，制備環(huán)糊精包合物脂質(zhì)體，可以提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，減少藥物泄漏，提高載藥量，改變藥物的體內(nèi)行為，同時使其具有緩釋性和靶向性。本實驗以全合成的新型小分子化合物N-[4-(4，6二甲基-2-嘧啶氧基)-3-甲基苯基]-N'-[2-(二甲氨基)]苯甲酰脲(SUD)為疏水性藥物模型，研究材料組成、制備工藝對包合物-脂質(zhì)體包封率的影響，考察其理化性質(zhì)、體外釋藥情況、大鼠體內(nèi)藥物動力學行為及小鼠的體內(nèi)分布，為這一新型給藥系統(tǒng)的應用提供實驗基礎。并采

4、用藥理學試驗方法進一步探討其脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)對人肺腺癌.A549細胞體外增殖的影響，為其作為抗腫瘤藥物應用于臨床提供實驗依據(jù)。
　　方法：以羥丙基-β-環(huán)糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD)為包合材料，分別用飽和水溶液法和研磨法制備了SUD-HP-β-CD包合物，通過對包合率及產(chǎn)率的評價，最后采用飽和水溶液法制備，通過四因素三水平正交實驗設計對制備工藝進行優(yōu)化，對包合率測定結(jié)果進行極差分析

5、，最后確定SUD-HP-β-CD包合物的最佳處方工藝，并采用差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry，DSC)和X射線粉末衍射(X-raydiffraction，XRD)法對所得到的包合物進行鑒定。
　　在文獻和預實驗的基礎上初步確定SUD-HP-β-CD包合物脂質(zhì)體的制備方法和處方，通過單因素考察初步確定脂質(zhì)體制備的影響因素，并研究不同包封率測定方法對包封率測定結(jié)果的影響；采用薄膜分散法

6、、注入法、逆向蒸發(fā)法、復乳法四種方法制備脂質(zhì)體，利用葡聚糖凝膠柱對脂質(zhì)體與未包封游離藥物進行分離。測定包封率，最終確定薄膜分散法為SUD-HP-β-CD包合物脂質(zhì)體的制備方法。以包封率為考察指標，通過單因素考察優(yōu)化脂質(zhì)體的制備工藝，并考察磷脂濃度、磷脂與膽固醇質(zhì)量比、水化液類型、藥物與磷脂質(zhì)量比等因素對脂質(zhì)體的影響。在此基礎上，采用四因素三水平正交試驗對各因素的水平進行篩選，對包封率測定結(jié)果進行極差分析，最后確定SUD-HP-β-CD包

7、合物脂質(zhì)體的最佳處方。
　　考察按照優(yōu)化處方制備的SUD-HP-β-CD包合物脂質(zhì)體的形態(tài)外觀，粒徑分布及黏度等指標，考察其理化穩(wěn)定性。分別繪制SUD-HP-β-CD包合物脂質(zhì)體和SUD-HP-β-CD包合物的體外釋藥曲線并比較其體外釋藥過程，分別用零級、一級、Higuchi及Weibull動力學方程進行擬合，并考察相關(guān)系數(shù)。
　　以高效液相法測定大鼠血漿及小鼠組織中SUD-HP-β-CD包合物脂質(zhì)體濃度。液相條件：色譜柱：

8、DiamonsilTM ODS C18(鉆石)250×4.6mm，5μm；以甲醇：水(80:20)v/v為流動相；檢測波長為232nm；柱溫：30℃；流速：1mL·min-1；進樣量為20μL。對結(jié)果進行處理，計算大鼠體內(nèi)各種藥動學參數(shù)，考察SUD-HP-β-CD包合物脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)分布，并進行靶向性評價。
　　常規(guī)培養(yǎng)人肺腺癌A549細胞，采用MTT法測定SUD-HP-β-CD包合物脂質(zhì)體對A549細胞增殖的抑制作用。流式細胞

9、儀測定細胞周期分布。Western blot法測定細胞增殖核抗原(PCNA)及細胞周期蛋白(cyclin D1)蛋白表達。初步探討SUD-HP-β-CD包合物脂質(zhì)體對人肺腺癌A549細胞體外增殖的影響。
　　結(jié)果：采用飽和水溶液法制備SUD-HP-β-CD包合物包合率較高，最佳制備工藝為SUD與HP-β-CD投料比為1:5，包合溫度為50℃，包合時間為90min，攪拌速度100轉(zhuǎn)/min，平均包合率為75.8％(n=3)DSC法對

10、包合物進行鑒定，發(fā)現(xiàn)SUD-HP-β-CD包合物在105℃出現(xiàn)新的吸熱峰。在XRD圖中，SUD)經(jīng)包合后，SUD的部分特征衍射峰消失或位移，表明確實形成了包合物。
　　通過單因素考察和正交實驗，篩選出了SUD-HP-β-CD包合物脂質(zhì)體的最優(yōu)處方為磷脂50mg·mL-1，磷脂與膽固醇質(zhì)量比5:1，藥脂比為1:30。根據(jù)優(yōu)化處方制備的SUD-HP-β-CD包合物脂質(zhì)體外觀為均勻的乳白色混懸液，包封率為76.32％，平均粒徑約為238

11、.4nm，多分散性系數(shù)為0.258。SUD-HP-β-CD包合物溶液的體外釋藥最符合Weibull方程，為ln[-ln(1-Q)]=0.9045lnt-1.4335，r2=0.9861。SUD-HP-β-環(huán)糊精包合物脂質(zhì)體混懸液體外釋藥符合一級動力學方程，為ln(1-Q)=-0.0824t+0.0517，r2=0.9893。穩(wěn)定性結(jié)果顯示：脂質(zhì)體在加熱條件下不穩(wěn)定；25℃條件下存放一個月，包封率下降33.6％，脂質(zhì)體沉淀分層明顯；在4℃

12、條件下存放一個月，包封率下降1.7％，穩(wěn)定性較好，說明脂質(zhì)體需在冷藏條件下保存。
　　藥動學實驗表明：SUD溶液和SUD-HP-β-CD包合物脂質(zhì)體靜脈給藥后，脂質(zhì)體組消除速率常數(shù)k為0.22h-1，溶液組的k為0.41 h-1，說明制成脂質(zhì)體后SUD在大鼠體內(nèi)的消除減慢。脂質(zhì)體組AUC為517.54μg·h·mL-1，溶液組.AUC為228.72μg·h·mL-1，表明脂質(zhì)體增加了藥物在機體中的生物利用度。小鼠體內(nèi)分布實驗表明：

13、SUD-HP-β-CD包合物脂質(zhì)體較溶液在心、脾和肺中的藥物濃度有較大增高，脂質(zhì)體組中心、脾、肺的re分別為3.01、3.14、2.71，說明脂質(zhì)體經(jīng)靜脈注射后在心、脾、肺組織有一定濃集，起到了一定的靶向目的。
　　MTT實驗結(jié)果表明，SUD-HP-β-環(huán)糊精包合物脂質(zhì)體對A549細胞瘤株的生長有明顯的抑制作用，隨著濃度增加和作用時間的延長，對細胞增殖的抑制作用逐漸增強。流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果表明：不同濃度含藥脂質(zhì)體作用48

14、h對A549細胞周期分布均有不同程度的影響，與空白對照組相比，1、5、10μg·mL-1 SUD-HP-β-環(huán)糊精包合物脂質(zhì)體組G0/G1期細胞百分率均明顯增加(P<0.05或P<0.01)。其中5、10μg·mL-1 SUD-HP-β-環(huán)糊精包合物脂質(zhì)體組S期細胞百分率明顯降低(P<0.01)。10μg/mL SUD-HP-β-環(huán)糊精包合物脂質(zhì)體組G2/M期細胞百分率也明顯降低(P<0.01)。說明SUD-HP-β-環(huán)糊精包合物脂質(zhì)體

15、可使A549細胞停滯在G0/G1期，從而抑制細胞增殖。Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組相比，空白脂質(zhì)體對PCNA、cyclin D1蛋白表達均沒有明顯影響。而5μg·mL-1 SUD原藥以及1、5、10μg·mL-1。SUD-HP-β-環(huán)糊精包合物脂質(zhì)體作用于A549細胞48h均不同程度地下調(diào)了PCNA和cyclin D1的蛋白表達(P<0.05或P<0.01)。
　　結(jié)論：以HP-β-CD為包合材料，以飽和水溶液法