低氧預(yù)適應(yīng)小鼠海馬、血清代謝組學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　氧是維持生命活動(dòng)必不可少的物質(zhì)，各種原因?qū)е碌臋C(jī)體供氧不足或用氧障礙，都可導(dǎo)致缺氧。作為以有氧代謝為主的組織，腦對(duì)缺氧的耐受性差，對(duì)缺氧極為敏感，急性嚴(yán)重缺氧在數(shù)分鐘內(nèi)即可引起腦神經(jīng)元的不可逆性損傷甚至死亡，長(zhǎng)期慢性缺氧也可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能紊亂和病理結(jié)構(gòu)改變。因此尋找防治低氧性神經(jīng)損傷，提高腦對(duì)低氧耐受性的措施，對(duì)于增強(qiáng)機(jī)體適應(yīng)低氧環(huán)境的能力及防治臨床缺氧性疾病具有重要意義。
　　低氧預(yù)適應(yīng)(hypoxia

2、 preconditioning，HPC)是體內(nèi)一種內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象，通過(guò)亞致死性低濃度氧反復(fù)短暫刺激細(xì)胞或組織，使其對(duì)隨后更嚴(yán)重的缺氧產(chǎn)生耐受，從而產(chǎn)生保護(hù)作用，廣泛存在于心、腦、腎、肝、腸等器官中。作為內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為增強(qiáng)機(jī)體適應(yīng)低氧環(huán)境的能力及防治缺氧性損傷提供了全新的思路。
　　本實(shí)驗(yàn)室既往的研究發(fā)現(xiàn)(1)HPC對(duì)小鼠海馬神經(jīng)元有明顯的保護(hù)作用，能顯著提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，證實(shí)HPC具有顯著的抗缺氧/缺血神經(jīng)

3、損傷作用;(2)急性重復(fù)低氧預(yù)適應(yīng)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中隨著小鼠低氧暴露次數(shù)的增加其缺氧耐受時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，重復(fù)低氧暴露2次、3次和4次的缺氧耐受時(shí)間分別是低氧暴露1次耐受時(shí)間的2、4、6倍，推測(cè)重復(fù)低氧暴露后小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了抗缺氧活性分子，且隨著缺氧次數(shù)的增加，抗缺氧活性分子的數(shù)量也在增加，存在著與藥物作用類似的劑量-效應(yīng)關(guān)系，從而導(dǎo)致小鼠的缺氧耐受時(shí)間逐步延長(zhǎng);(3)通過(guò)建立急性重復(fù)缺氧HPC小鼠模型，發(fā)現(xiàn)HPC組的腦組織勻漿液具有顯著抗缺氧神

4、經(jīng)損傷作用，其中蛋白組分和非蛋白組分均可以顯著增強(qiáng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）誘導(dǎo)分化的PC12細(xì)胞的缺氧耐受性，提示小分子代謝物在其中發(fā)揮重要的作用，但是具體是哪些活性物質(zhì)在低氧預(yù)適應(yīng)形成過(guò)程中發(fā)揮抗缺氧損傷的作用尚不清楚。
　　代謝組學(xué)是對(duì)某一生物或細(xì)胞在一特定生理時(shí)期內(nèi)所有低分子量(＜1000KDa)代謝產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析的一門學(xué)科，反映機(jī)體對(duì)外界刺激、病理生理變化及本身基因突變而產(chǎn)

5、生的體內(nèi)代謝物水平多元?jiǎng)討B(tài)變化。作為各種“組學(xué)”的終端，代謝組學(xué)更能直接、準(zhǔn)確地反應(yīng)當(dāng)前機(jī)體的病理生理狀態(tài)。
　　本研究的目的在于通過(guò)建立急性缺氧HPC小鼠模型，利用超高效液相色譜四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flightmass spectrometry，UPLC-Q-TOFMS)的代謝組學(xué)技術(shù)，分離鑒定HPC小鼠與對(duì)

6、照組小鼠海馬、血清中差異代謝物，并對(duì)部分結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討機(jī)體如何適應(yīng)缺氧環(huán)境以及HPC潛在的保護(hù)機(jī)制。
　　方法：
　　第一部分:低氧預(yù)適應(yīng)小鼠海馬代謝組學(xué)研究
　　1.60只雄性BALB/C小鼠隨機(jī)分為3組，常氧對(duì)照組(H0)，低氧暴露1次組(H1)，重復(fù)低氧暴露4次組(HPC)，每組20只，;按文獻(xiàn)報(bào)道復(fù)制急性缺氧HPC小鼠模型，麻醉，斷頭取海馬組織。海馬組織樣本均隨機(jī)分為2份，1份用于生化指標(biāo)測(cè)

7、定，一份用于代謝組學(xué)分析。代謝組學(xué)分析利用UPLC-Q-TOFMS技術(shù)結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析篩選各組差異代謝物，MetaboAnalyst3.0數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行代謝通路富集分析;
　　2.部分代謝組學(xué)結(jié)果的驗(yàn)證，分別檢測(cè)各組小鼠海馬組織中SOD活性、MDA和乳酸含量。
　　第二部分:低氧預(yù)適應(yīng)小鼠血清代謝組學(xué)研究
　　1.按照相同的動(dòng)物分組和方法復(fù)制HPC小鼠模型，麻醉，眼眶采血法取血并分離血清。血清樣本均隨機(jī)分為2份，1份用于

8、生化指標(biāo)測(cè)定，一份用于代謝組學(xué)分析。代謝組學(xué)分析采用UPLC-Q-TOFMS結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析篩選各組小鼠血清差異代謝物，MetaboAnalyst3.0數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行代謝通路富集分析;
　　2.檢測(cè)各組小鼠血清中SOD活性、MDA和乳酸含量，驗(yàn)證部分代謝組學(xué)結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠海馬組織代謝組學(xué)研究共鑒定出37種差異代謝物，與H0組相比HPC組中多巴胺、腺苷、苯丙氨酸、牛磺酸等代謝物顯著上調(diào)，5-甲基胞苷、谷氨

9、酸、谷氨酰胺、乙酰膽堿、胞苷、NADH、2-羥戊二酸、尿酸、花生四烯酸、油酸、亞油酸、軟脂酸、溶血磷脂酰膽堿、谷胱甘肽等代謝物在H1組升高，HPC組降低，而色氨酸、鞘氨醇、黃嘌呤則在H1和HPC組均降低。這些代謝物涉及的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成，?；撬岷蛠喤；撬岽x，谷胱甘肽代謝，乙醛酸和二羧酸代謝，花生四烯酸代謝，亞油酸代謝，酪氨酸代謝，甘油磷脂代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，色氨酸代謝，苯丙氨酸代謝和三羧酸循環(huán)等代謝通路發(fā)生

10、顯著變化;
　　2.HPC組小鼠海馬組織中SOD活性升高，較H0、H1組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;與H0組相比，H1組、HPC組小鼠海馬組織中MDA和乳酸含量均升高，且數(shù)據(jù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;與H1組相比，HPC組小鼠海馬組織中MDA和乳酸含量顯著降低;
　　3.小鼠血清代謝組學(xué)研究共篩選鑒定出25種差異代謝物，其中纈氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、?；撬嵩贖PC組中顯著升高，長(zhǎng)鏈肉毒堿、蛋氨酸、花生四烯酸、溶血磷脂酰膽堿、尿酸相對(duì)含量

11、在H1組中升高HPC組中降低，這些代謝物涉及的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成，?；撬帷喤；撬岽x，亞油酸代謝，花生四烯酸代謝等代謝通路均發(fā)生顯著變化;
　　4.與H0組相比，H1組和HPC組小鼠血清中SOD活性均升高，且HPC組最高，每?jī)山M之間數(shù)據(jù)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;與H0組相比，H1組、HPC組小鼠血清中MDA和乳酸含量均升高，且數(shù)據(jù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;與H1組相比，HPC組小鼠海馬組織中MDA和乳酸含量顯著降低。
　　結(jié)論：

12、
　　1.HPC小鼠血清、海馬組織代謝模式發(fā)生顯著改變，其中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成，?；撬?、亞?；撬岽x，花生四烯酸代謝，亞油酸代謝，苯丙氨酸代謝，酪氨酸代謝通路為共同發(fā)生改變的代謝通路，谷胱甘肽代謝，丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝僅在海馬組織中有顯著變化，上調(diào)（抑制）其中的關(guān)鍵代謝酶或許能提高全身或中樞神經(jīng)系統(tǒng)抗缺氧損傷能力;
　　2.代謝組學(xué)數(shù)據(jù)中與清除氧化自由基有關(guān)的物質(zhì)谷胱甘肽、尿酸等代謝物變化和小鼠海馬組織和血