基于質(zhì)譜技術(shù)的癌癥血清代謝組學(xué)研究.pdf

1、癌癥,即惡性腫瘤,是當(dāng)今社會致死率最高的疾病。國際抗癌聯(lián)盟發(fā)布的數(shù)據(jù)表明,2008年,全球有1270萬人患癌,死亡人數(shù)高達760萬。在我國,每年有180萬人因癌癥喪生。因此,發(fā)展用于癌癥早期診斷和相關(guān)癌癥標(biāo)志物篩查的方法具有重要的臨床意義。代謝組學(xué)(metabonomics/metabolomics)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)之后新近發(fā)展起來的一門學(xué)科,是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分,它己被廣泛用于多種疾病的診斷、相關(guān)標(biāo)志物篩查和病

2、理生理學(xué)解釋等方面。目前,核磁共振波譜法(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy,NMR)和質(zhì)譜法(Mass Spectrometry,MS)是最常用的兩種代謝組學(xué)分析技術(shù)。與NMR.相比,MS由于具有高靈敏度、高準(zhǔn)確性、寬動態(tài)范圍、可得到化合物準(zhǔn)確分子量、易于與各種色譜聯(lián)用、鑒定能力強等優(yōu)點,近年來已經(jīng)成為代謝組學(xué)研究中不可或缺的一種手段。
　　 本論文著重發(fā)展了基于質(zhì)譜技術(shù)的血清代謝組

3、學(xué)分析平臺,將其應(yīng)用于癌癥診斷、標(biāo)志物篩查以及病理學(xué)解釋等方面。以下是主要研究內(nèi)容和成果:
　　 1、基于直接注入式質(zhì)譜法(Direct Injection Mass Spectrometry,DIMS)和液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,LC-MS)技術(shù)的代謝組學(xué)研究。在基于質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學(xué)分析方法中,雖然LC-MS的分析技術(shù)是目前最常用的,但是與色譜的聯(lián)用限

4、制了該方法的高通量性,同時也增加了數(shù)據(jù)處理的復(fù)雜性。近年來,隨著高分辨率質(zhì)譜的發(fā)展,人們開始嘗試不經(jīng)過色譜分離,而采用直接注入的方式來對樣品進行質(zhì)譜分析,初步結(jié)果令人滿意。本工作以腎癌患者和健康人血清樣品為模型,考察上述兩種分析方法在實際應(yīng)用中的性能差異。在腎癌預(yù)測和診斷方面,DIMS可以得到與LC-MS相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果,考慮到該種分析方法的高通量性(＜2 min),其有望成為腎癌快速診斷的新手段。而在癌癥標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)方面,通過DIMS方法發(fā)現(xiàn)

5、了14種潛在標(biāo)志物,而LC-MS方法則發(fā)現(xiàn)了29種,且前者發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志物在后者中均有發(fā)現(xiàn),這說明LC-MS方法更適合于疾病相關(guān)標(biāo)志物的全面篩查。
　　 2、LC-MS分析技術(shù)對腎癌標(biāo)志物的全面篩查。本工作采用反相色譜(Reversed Phase Liquid Chromatography,RPLC)和親水相互作用色譜(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography,HILIC)分別與質(zhì)

6、譜聯(lián)用的方法,考察了兩種分離技術(shù)共同使用的必要性。結(jié)果表明,親水相互作用色譜可以分離反相色譜所不能保留的強極性化合物,兩種分離技術(shù)的配合使用有利于血清樣品的全面分析,整合后的新數(shù)據(jù)集可以得到更好的聚類和預(yù)測結(jié)果。該研究所發(fā)展的分析方法不僅可以用于腎癌的早期預(yù)測和診斷,還展示出了進行腎癌病理學(xué)分期的潛力。此外,本工作共發(fā)現(xiàn)了46種腎癌潛在標(biāo)志物并鑒定了其中的30種。對這些標(biāo)志物的代謝路徑的研究結(jié)果表明,腎癌患者體內(nèi)存在異常的磷脂代謝、鞘脂

7、類代謝、苯丙氨酸代謝、色氨酸代謝、脂肪酸轉(zhuǎn)移與氧化、膽固醇代謝以及花生四烯酸代謝等過程。這些標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)不僅有利于更好地理解腎癌患者的病理生理學(xué)變化,同時也提供了潛在的飲食或化學(xué)療法信息。
　　 3、泌尿系統(tǒng)多種癌癥的診斷及特異性標(biāo)志物的篩查。目前,在絕大多數(shù)的代謝組學(xué)研究中,對診斷方法和標(biāo)志物的評估還局限在對健康人和所研究的疾病病人的比較上,這種狹隘的評估方法直接導(dǎo)致了標(biāo)志物缺乏特異性的研究通病,這也成為代謝組學(xué)發(fā)展所面臨的一

8、個十分棘手的問題。在此背景下,本工作首次對兩類泌尿系統(tǒng)癌癥進行同時研究,并發(fā)展了一套可供借鑒的標(biāo)志物篩查和評估方法。在該研究中,為了實現(xiàn)客觀的評估,實驗所用到的測試集中除了包含腎癌、膀胱癌患者和健康人的血清樣品外,還包含了其他泌尿系統(tǒng)癌癥患者和非惡性泌尿系統(tǒng)疾病患者的樣品。研究表明:在訓(xùn)練集的對照組中加入非惡性疾病的患者對提高診斷方法和標(biāo)志物的特異性是十分必要的;優(yōu)化后的模型可以實現(xiàn)對腎癌和膀胱癌的高靈敏度和高特異性的檢測,初步展示了該

9、方法對泌尿系統(tǒng)不同類型癌癥進行同時診斷的能力。此外,通過嚴(yán)格的篩查,分別發(fā)現(xiàn)了5種膀胱癌特異性標(biāo)志物、5種腎癌特異性標(biāo)志物和7種癌癥共同的標(biāo)志物。采用受試者工作特征曲線(Receiver Operating Characteristic,ROC)對標(biāo)志物的靈敏度和特異性進行評估,結(jié)果表明這些標(biāo)志物具有用于癌癥臨床診斷的潛力。
　　 4、直接注入式傅立葉變換質(zhì)譜法(Direct Infusion Fourier Transform

10、 MassSpectrometry,DI-FT-MS)對癌癥的快速診斷。FT-MS是性能最為杰出的高端質(zhì)譜儀,其特有的超高分辨率和準(zhǔn)確性使其十分適合于直接進樣的分析方法。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上,發(fā)展了適合于血清樣品代謝組學(xué)分析的DI-FT-MS技術(shù),旨在探討其對不同類型癌癥快速診斷的可能性。我們的研究結(jié)果表明:不同類型的泌尿系統(tǒng)癌癥具備顯著的代謝譜差異;而基于DI-FT-MS的檢測技術(shù)通過結(jié)合多變量的數(shù)據(jù)分析方法,就能夠有效地對差異譜