熒光標(biāo)記LDR-PCR復(fù)合擴(kuò)增方法對(duì)高度降解DNA檢材的SNPs分型研究.pdf

1、前言：
　　 法醫(yī)DNA分析技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展，有力地提高了法醫(yī)實(shí)踐中個(gè)人識(shí)別和親子鑒定的能力，已經(jīng)成為法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最為基本和重要的技術(shù)，并且在世界范圍內(nèi)得到廣泛認(rèn)可和應(yīng)用。同樣，DNA分析技術(shù)也面臨著諸多挑戰(zhàn)，尤其是在實(shí)際檢驗(yàn)過(guò)程中，法醫(yī)鑒定人員有時(shí)要面對(duì)高度降解的生物學(xué)檢材。
　　 為了解決高度降解DNA檢材的個(gè)人識(shí)別難題，許多實(shí)驗(yàn)室采用縮短靶DNA片段的擴(kuò)增子長(zhǎng)度這一基本策略，其中最具代表性的就是miniSTR技術(shù)。

2、但是受STR核心重復(fù)序列固有片段長(zhǎng)度的限制，大多數(shù)STR基因座的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度集中介于100bp～200bp，對(duì)于小于100bp的DNA片段，miniSTR技術(shù)尚不能提供足量、可靠的遺傳學(xué)信息。
　　 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）是指特定核苷酸位置上存在兩種不同的堿基，每種基因型在群體分布頻率不低

3、于1％。由于其多態(tài)性存在于單個(gè)堿基上，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度能夠大幅縮短，又因其具有分布廣泛，突變率低等特點(diǎn)，SNPs檢測(cè)在降解檢材的個(gè)人識(shí)別中逐漸引起法醫(yī)學(xué)者的重視。
　　 近年來(lái)，一種基于連接酶檢測(cè)反應(yīng)(ligase detection reaction，LDR)的SNPs分型技術(shù)得到迅速發(fā)展，為解決降解DNA法醫(yī)學(xué)分析難題提供了新的契機(jī)。LDR中寡核苷酸探針在設(shè)計(jì)時(shí)需保證能與靶序列特異性地雜交，并且不能影響后續(xù)的連接反應(yīng)，所以

4、對(duì)探針長(zhǎng)度要求并不是很?chē)?yán)格，數(shù)十個(gè)核苷酸即能滿(mǎn)足需要;此外，對(duì)于雙鏈DNA的單鏈缺口，DNA連接酶的識(shí)別和連接反應(yīng)具有高度的嚴(yán)謹(jǐn)性，適合應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)降解檢材的DNA分析上。目前對(duì)降解檢材DNA應(yīng)用LDR技術(shù)進(jìn)行分析只能實(shí)現(xiàn)對(duì)4個(gè)SNPs位點(diǎn)的復(fù)合分型，尚不能滿(mǎn)足法醫(yī)學(xué)個(gè)人識(shí)別的要求。因此，本研究嘗試構(gòu)建一套基于LDR的熒光標(biāo)記PCR復(fù)合擴(kuò)增體系，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)8個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)，提高其法醫(yī)學(xué)個(gè)人識(shí)別力，同時(shí)探討對(duì)福爾馬林固定石蠟包

5、埋組織(Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissues，F(xiàn)FPET)中降解DNA的分型的可行性，為解決高度降解DNA法醫(yī)學(xué)分析難題提供新的策略。
　　 材料和方法：
　　 1、中國(guó)北方地區(qū)漢族個(gè)體末梢靜脈血樣，枸櫞酸鈉抗凝;選取一具冰凍尸體的腦、肺、心肌、腎和肝組織塊按常規(guī)方法制作FFPET，同時(shí)取尸體心腔血液作為陽(yáng)性對(duì)照。
　　 2、酚/氯仿法提取血液DNA，二甲苯脫蠟

6、法和Chelex-100法提取FFPET檢材DNA。
　　 3、選擇8個(gè)SNPs位點(diǎn)(rs10802248、rs10516197、rs10488372、rs2278945、rs4757318、rs4887255、rs4889002和rs9304473)，設(shè)計(jì)合成SNPs位點(diǎn)的LDR探針和連接產(chǎn)物PCR引物，通過(guò)連接酶檢測(cè)反應(yīng)，PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管凝膠電泳(capillary gel electrophoresis，CGE)，構(gòu)建復(fù)

7、合擴(kuò)增SNPs分型體系。
　　 4、對(duì)FFPET檢材降解DNA分別進(jìn)行AmpF(l)STR(R) Identifiler(R) PCRAmplification Kit分型檢測(cè)和熒光標(biāo)記LDR-PCR復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)，對(duì)兩者分型結(jié)果進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果：
　　 1、經(jīng)10％中性福爾馬林溶液固定3天后所有的FFPET的DNA即發(fā)生明顯的降解。隨著固定時(shí)間的延長(zhǎng)，降解程度逐漸加劇，并且不同組織類(lèi)型的降解速率呈現(xiàn)出明顯差

8、異。15天后腦FFPET檢材DNA片段降解到lkbp以下，心肌FFPET檢材DNA在500bp以下，肺臟和腎臟FFPET檢材DNA在200bp以下，肝臟FFPET檢材DNA在100bp以下。
　　 2、本研究使用熒光標(biāo)記LDR-PCR復(fù)合擴(kuò)增方法，對(duì)不同個(gè)體的8個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行一次性分型，每個(gè)SNP位點(diǎn)純合子為單一產(chǎn)物峰，雜合子為長(zhǎng)度相差2bp的兩個(gè)產(chǎn)物峰，對(duì)于擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度有所重疊著，由于使用不同的熒光標(biāo)記物，能完全實(shí)現(xiàn)正確分

9、型。對(duì)所有的檢測(cè)個(gè)體的8個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與LDR-PCR分型結(jié)果完全一致。
　　 3、對(duì)于FFPET檢材高度降解DNA檢材，熒光標(biāo)記LDR-PCR復(fù)合擴(kuò)增體系能夠?qū)崿F(xiàn)8個(gè)SNPs位點(diǎn)的準(zhǔn)確分型，AmpF(l)STR(R) Identifile(R) PCR AmplificationKit則無(wú)法提供全部15個(gè)STR分型結(jié)果。
　　 結(jié)論：
　　 1、熒光標(biāo)記LDR-PCR復(fù)合擴(kuò)增方