熒光標記8個miniSTR及Amelogenin復合擴增體系的建立.pdf

1、目前，PCR-STR技術已經廣泛應用于國內外法庭DNA實驗室，成為個人識別和親權鑒定最主要的技術手段。在實際工作中，受氣候、環(huán)境、物理及化學等多種因素影響，該技術對降解檢材進行STR分型時經常出現優(yōu)勢擴增或者大片段基因座漏擴。如何提高降解DNA樣本STR分型成功率成為國內外法醫(yī)DNA專家關注的熱點。miniSTR技術通過重新設計引物，使引物更靠近重復序列，減少片段長度，能提高降解檢材STR分型的成功率。目前法醫(yī)學上廣泛使用的CODIS核

2、心STR基因座等位基因數較多，片段長度跨度較大，構建miniSTR復合擴增體系時只能同時擴增較少的基因座，一次擴增的系統(tǒng)效能較低。為此，尋找CODIS系統(tǒng)之外的適于建立miniSTR體系的基因座，建立高效的miniSTR復合擴增體系十分必要。本研究篩選了11個非CODIS系統(tǒng)的miniSTR基因座進行單個基因座的研究，從中選了多態(tài)性較好的8個miniSTR及Amelogenin建立熒光標記的復合擴增體系，顯示出良好的應用前景。
　

3、　 本研究通過查找文獻及網站，合成PCR引物進行擴增，應用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR產物，銀染法顯帶，初步篩選了11個miniSTR基因座：D20S1082、D6S474、D12ATA63、D9S1122、D2S1776、D1S1627、D3S4529、D2S441、D4S2364、D4S2408、D1GATA113。根據復合體系中各基因座的分布，調整部分基因座的引物，合成11個基因座的熒光標記引物并進行單個基因座擴增，產物應用毛細

4、管電泳檢測，檢驗了廣州漢族100個無關個體的血樣，獲得11個基因座的群體遺傳學數據。選擇了其中多態(tài)性較高的8個基因座D20S1082、D6S474、D12ATA63、D9S1122、D2S1776、D1S1627、D3S4529、D2S441，加入性別鑒定的Amelogenin基因座，經引物調整和組分優(yōu)化后構建熒光復合擴增體系。然后，應用分子克隆技術，對9個基因座的58個等位基因進行克隆，調整各基因座等位基因的含量，制備該體系的等位基因

5、分型標準物。最后，對該體系的靈敏度、種屬特異性、可重復性等進行評估，并對陳舊、腐敗降解檢材DNA的檢驗能力進行研究。
　　 熒光標記單個基因座的研究結果顯示，11個miniSTR基因座均能檢出分型明確的圖譜。在100名廣州漢族無關個體中D20S1082、D6S474、D12ATA63、D9S1122、D2S1776、D1S1627、D3S4529、D2S441、D4S2364、D4S2408、D1GATA113基因座分別檢出9、

6、6、8、8、7、6、5、9、5、5、和4個等位基因。通過Fisher精確檢驗，該11個基因座的基因型數據均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(P＞0.05)。11個miniSTR基因座的雜合度在0.6078～0.8137之間，個人識別率在0.7784～0.9241之間，非父排除率在0.3004～0.6248之間、多態(tài)性信息總量在0.5329～0.7702之間。
　　 本研究成功地建立了熒光標記8個miniSTR及Amelo

7、genin復合擴增體系，對常見的各類檢材均能檢出很好的STR分型圖譜。按公式計算，該體系8個miniSTR基因座的累計個人識別率為0.99999993，累計非父排除率為0.992287。該體系的檢測靈敏度為0.05ng模板DNA，具有種屬特異性和組織同一性，對肯定親緣關系30例父-母-子樣本進行檢測未發(fā)現違反孟德爾遺傳規(guī)律的現象。對50份陳舊血樣的比對檢驗顯示，該體系對降解檢材有良好的擴增效果，較常規(guī)試劑盒的分型成功率高(p＜0.05)