歸芪多糖延緩衰老作用及機(jī)制研究.pdf

1、當(dāng)歸和黃芪，是我國歷史悠久、臨床應(yīng)用廣泛的中草藥，是甘肅省的道地藥材。當(dāng)歸具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便的功效，黃芪具有增強(qiáng)免疫、保肝、利尿、抗衰老、抗應(yīng)激等作用。歸芪多糖是是依據(jù)古驗(yàn)方“當(dāng)歸補(bǔ)血湯”，將當(dāng)歸和黃芪以特定比例(1∶5)混合水煎提取出的復(fù)合多糖。前期研究結(jié)果表明，歸芪多糖具有延緩衰老、抗氧化、抗病毒及保護(hù)肝損傷等作用，然而，其延緩衰老的作用機(jī)制尚不明確。
　　本文以過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的WI-38早衰細(xì)胞模型和

2、D-半乳糖誘導(dǎo)的早衰大鼠模型為研究對(duì)象，對(duì)歸芪多糖體內(nèi)外延緩衰老的作用及作用機(jī)制進(jìn)行研究。按照課題組前期研究的最佳超聲輔助提取工藝制備出歸芪多糖、當(dāng)歸多糖和黃芪多糖（超聲頻率為120W，提取溫度為80℃，提取時(shí)間為2h，料液比為1:10，當(dāng)歸和黃芪的質(zhì)量比為1:5），其提取率分別為9.11％、8.7%和9.3%，苯酚-硫酸法測(cè)得多糖含量分別為87.6%、79.3%和89.1%。采用MTT法，研究不同濃度 H2O2（1，10，100，20

3、0，400，800，1600，3200，6400μmol/L）對(duì)WI-38細(xì)胞活力的影響，篩選出用于誘導(dǎo)細(xì)胞早衰的最佳H2O2濃度。結(jié)果顯示，200μmol/L H2O2誘導(dǎo)的WI-38細(xì)胞（第18代）出現(xiàn)早衰，與復(fù)制衰老組細(xì)胞（第55代）在細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期、β-半乳糖苷酶活性及端粒酶活性方面均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），與正常對(duì)照組細(xì)胞比較差異顯著（P<0.01）。以傳至第18代的WI-38細(xì)胞為研究對(duì)象，采用MTT法，研究不同劑

4、量的歸芪多糖（0.00064，0.0032，0.016，0.08，0.4，2 mg/mL）對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，其結(jié)果表明，歸芪多糖可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，且隨著歸芪多糖濃度的增加，細(xì)胞存活率先增加后降低，最佳促生長(zhǎng)濃度為0.016mg/mL，此時(shí)細(xì)胞的相對(duì)活力為正常細(xì)胞對(duì)照組的1.68倍，因此，本研究中選取0.016mg/mL為歸芪多糖的實(shí)驗(yàn)劑量濃度。將WI-38細(xì)胞隨機(jī)分為5組，分別為歸芪多糖組（歸芪多糖+H2O2處理）、當(dāng)歸多糖組（當(dāng)歸多糖

5、+H2O2處理）、黃芪多糖組（黃芪多糖+H2O2處理）、H2O2模型組（僅H2O2處理）和正常對(duì)照組（傳至第18代的WI-38細(xì)胞），以細(xì)胞形態(tài)、β-半乳糖苷酶活性、端粒酶活性、活性氧量、DNA復(fù)制能力、細(xì)胞周期及衰老相關(guān)的p53和p16蛋白的表達(dá)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別采用ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光等技術(shù)，從細(xì)胞水平和分子水平研究歸芪多糖對(duì)WI-38細(xì)胞延緩衰老的作用及作用機(jī)制。結(jié)果顯示，一定濃度的歸芪多糖作用于細(xì)胞后，細(xì)胞未呈現(xiàn)出衰老

6、樣形態(tài)，同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)活性氧量、SA-β-半乳糖苷酶活性有所降低，而端粒酶活性增強(qiáng)、細(xì)胞增殖加快、G1期的細(xì)胞快速進(jìn)入分裂期，與 H2O2模型組相比差異顯著（P<0.01），與正常對(duì)照組無顯著性差異（P>0.05）。且與當(dāng)歸多糖組和黃芪多糖組相比略有差異（P<0.05）。同時(shí)，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，H2O2誘導(dǎo)的第18代WI-38細(xì)胞呈現(xiàn)出p53和p16蛋白的高表達(dá)（P<0.01，P<0.05）；而歸芪多糖組的p

7、53和p16蛋白表達(dá)量明顯下降（P<0.01，P<0.05），與正常對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；且歸芪多糖的作用效果優(yōu)于當(dāng)歸多糖和黃芪多糖（P<0.05）。據(jù)此推測(cè)，歸芪多糖可能是通過調(diào)控細(xì)胞周期、增強(qiáng)端粒酶活性并抑制 p53-p21和p16-pRb信號(hào)通路的途徑達(dá)到其延緩細(xì)胞衰老的作用。采用人工復(fù)制衰老動(dòng)物模型（D-半乳糖誘導(dǎo)）的方法建立大鼠衰老模型，通過灌服不同劑量的歸芪多糖，研究歸芪多糖對(duì)衰老大鼠血常規(guī)、血生化指標(biāo)和免疫臟