哈蟆油延緩衰老的作用及機(jī)制初探.pdf

1、衰老是機(jī)體正常而復(fù)雜的生命過程，是各組織、器官的退行性變化。隨著人類進(jìn)入老齡化社會，老年機(jī)體的生理病理特點成為熱門的研究對象。《2012中國發(fā)展報告》顯示，2011年全國60歲及以上人口達(dá)到18499萬，占總?cè)丝诘?3.7％，比2010年增加了0.47個百分點;65歲及以上人口達(dá)到12288萬，占總?cè)丝诘?.1％，比2010年增加了0.25個百分點。在人口老齡化程度持續(xù)并快速加深的同時，高齡老人比重的逐步提高，使老年人口結(jié)構(gòu)進(jìn)一步向高齡

2、化過渡，高齡化態(tài)勢愈發(fā)明顯。學(xué)習(xí)與記憶是大腦的重要功能，是一個多階段的動態(tài)神經(jīng)活動過程，衰老的重要表現(xiàn)之一是學(xué)習(xí)記憶功能減退。海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，在學(xué)習(xí)記憶中起著重要作用，有研究表明它的結(jié)構(gòu)和功能改變在衰老時發(fā)生較早且較為嚴(yán)重。目前，中國老齡和高齡人群的健康研究以及老年醫(yī)學(xué)的發(fā)展，尤其是嚴(yán)重危害老年人群身心健康的神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究，遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于人口老齡化和高齡化的步伐。因此研究與年齡有關(guān)的海馬變化，延緩腦部衰老就成了一個迫切需

3、要解決的問題。
　　 中醫(yī)對抗衰老的研究由來已久，補(bǔ)腎益精學(xué)說占據(jù)重要地位。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為腎主骨生髓，腎中精氣充盈，則髓海得養(yǎng)，腦就能充分發(fā)揮其“精明之府”的生理功能。
　　 哈蟆油為蛙科動物中國林蛙雌蛙的輸卵管，經(jīng)采制干燥而得。味甘，咸，性平。歸肺、腎經(jīng)，功能補(bǔ)腎益精，養(yǎng)陰潤肺。宋代蘇頌的《本草圖經(jīng)》和明代李時珍的《本草綱目》對此均有記載;清朝時期，哈蟆油是被譽(yù)為“八珍之首”的上等貢品?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實哈蟆油具有清

4、除自由基、修復(fù)損傷的基因、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、延緩細(xì)胞衰老等作用。
　　 文獻(xiàn)研究顯示其能顯著延長果蠅的平均壽命和最高壽命，具有很好的抗衰老作用。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，以哈蟆油為主藥的中藥復(fù)方益婦寧可以通過多環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌功能，治療更年期綜合癥及有關(guān)諸證療效確切;同時哈蟆油明顯提高D-半乳糖所致衰老大鼠血清和肝組織超氧化物歧化酶(SOD)，銅鋅超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)，過氧化物酶(POD)和總抗氧化能力(T-A

5、OC)活性，提示哈蟆油具有良好的抗衰老作用，有關(guān)其作用的具體機(jī)制，目前國內(nèi)外尚未見報道。
　　 從分子生物學(xué)角度研究衰老期間有關(guān)基因及其調(diào)控變化，已成衰老研究的方向。生長停滯是細(xì)胞衰老的突出表現(xiàn)，其中Rb/p53細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路控制信號至關(guān)重要，處于兩個衰老誘導(dǎo)途徑核心位置的是幾個抑癌基因產(chǎn)物，包括Rb、p53、p19及p21。當(dāng)這些途徑涉及的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子發(fā)生突變，細(xì)胞將延緩衰老或繞過衰老程序繼續(xù)增殖。研究發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶B(TrkB

6、)是腦源性神經(jīng)因子(BDNF)的高親和力受體。二者廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對神經(jīng)元的生存、生長、分化有重要的影響。
　　 哈蟆油延緩衰老的具體機(jī)制是否通過P19/Rb或P21/Rb途徑，是否影響衰老動物海馬的BDNF-TrkB通路基因和蛋白的變化，是本研究的重點內(nèi)容。因此，本課題采用了16-18月齡自然衰老雌性大鼠模型，研究哈蟆油對其血清及大腦抗衰老能力的改善作用，通過觀察哈蟆油對自然衰老大鼠細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路P19/Rb、P21

7、/Rb和BDNF-TrkB主要基因和蛋白表達(dá)變化，探討哈蟆油抗腦衰老的機(jī)制。
　　 目的:研究哈蟆油對自然衰老雌性大鼠大腦抗衰老的作用機(jī)制，探討P19/Rb、P21/Rb和BDNF-TrkB信號通路在大鼠衰老過程中的作用，以期證實哈蟆油抗衰老的分子基礎(chǔ)，闡明其主要療效機(jī)理，為中藥抗衰老提供理論基礎(chǔ)和新的治療靶點。
　　 方法:
　　 1.果蠅生存實驗:800只黑腹果蠅，雌雄各半，隨機(jī)分為空白對照組(Control

8、)、維生素E組(VE)、哈蟆油高、低劑量組(High/Low dose of OR Group，OR H/L)，每組200只。
　　 2.16-18月齡SD雌性大鼠24只為實驗動物，隨機(jī)分為老年對照組(AC)、己烯雌酚組(DT)和哈蟆油高、低劑量組(High/Low dose of OR group，OR H/L)。3-4月齡SD大鼠6只作成年對照組(YC)。AC組和YC組灌胃空白植物油，各給藥組大鼠給予0.05 mg/kg己烯

9、雌酚、1.8g/kg哈蟆油、0.9 g/kg哈蟆油，連續(xù)給藥6周，觀察大鼠進(jìn)食、飲水、毛色等一般情況，每周稱一次體重。(1)通過HE和尼氏染色觀察大鼠海馬組織病理學(xué)變化。(2)實驗結(jié)束各組大鼠腹主動脈采血分離血清，并取腦組織冰浴勻漿，檢測血清、組織勻漿SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)的含量，以評價哈蟆油對自然衰老雌性大鼠抗氧化水平的作用。(3)用實時熒光定量法、免疫組織化學(xué)方法和免疫

10、印跡法檢測各組海馬BDNF-TrkB和P21-Rb通路相關(guān)BDNF、TrkB、P21、8-OHDG等蛋白或基因的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.果蠅生存實驗:與Control組比較，VE組、OR H/L平均壽命和最高壽命均顯著延長。
　　 2.大鼠一般情況及HE、尼氏染色:實驗過程中各組大鼠均未見拒食、腹瀉、分泌物增多、呼吸困難、眼球突出等異常情況。YC組大鼠神態(tài)活潑，活動未見異常，毛發(fā)致密且光澤亮白，體重持續(xù)增

11、長。AC組大鼠神態(tài)萎靡不振，活動較少，毛發(fā)干枯，光澤性減少，色澤暗黃，且脫落明顯。ORH/L和DT組大鼠具有AC組類似的衰老體征，但有所改善，動物神態(tài)較興奮且活動多。
　　 光鏡下觀察YC組大鼠海馬錐體細(xì)胞排列整齊緊密、層次分明，形態(tài)完整，無變性，無膠質(zhì)細(xì)胞增生。可見多量顆粒狀或斑塊狀的尼氏體(Nissl body)，分布于核周細(xì)胞質(zhì)及樹突內(nèi)。AC組大鼠海馬錐體細(xì)胞排列疏松紊亂，層次欠清晰，細(xì)胞脫失明顯，尤以CA3區(qū)顯著，錐體細(xì)

12、胞明顯減少，胞體變形，胞核體積變小，呈核固縮，染色較深，尼氏體形態(tài)變化，數(shù)量較少，甚至溶解。OR H/L組大鼠海馬神經(jīng)元脫失現(xiàn)象較AC組有改善，細(xì)胞層次較分明，錐體細(xì)胞排列較AC組整齊，形態(tài)較完整，尼氏體形態(tài)較正常，數(shù)量較AC組明顯增多。
　　 3.抗氧化指標(biāo):YC組大鼠各抗氧化酶活力均維持在較高水平;與AC組相比，OR H/L組血清、腦勻漿SOD、GSH-Px活力顯著升高，MDA、H2O2含量顯著降低。
　　 4.實時

13、熒光定量:結(jié)果顯示，雌性大鼠海馬組織AC組P19 mRNA表達(dá)與YC組比較升高(95％CI:[0.603，0.646])。與AC組比較，DT組P19 mRNA表達(dá)無顯著性差異(95％CI:[0.878，1.108]); OR H/L組P19 mRNA表達(dá)有顯著性差異(95％CI分別為[0.937，0.991]、[0.897，0.990])。與DT組比較，OR H/L組P19 mRNA表達(dá)無顯著性差異(P值分別為0.843，0.557)。

14、
　　 雌性大鼠海馬組織AC組P21 mRNA表達(dá)與YC組比較升高(95％CI:[0.301，0.412])。與AC組比較，DT組P21 mRNA表達(dá)升高(95％CI:[1.274，1.300]);OR H/L組P21 mRNA表達(dá)下降(95％CI分別為[0.726，0.741]、[0.432，0.463])。與DT組比較，OR H/L組P21 mRNA表達(dá)降低(P值均為0.000)。
　　 雌性大鼠海馬組織AC組P53

15、 mRNA表達(dá)與YC組比較升高(95％CI:[0.805，0.855])。與AC組比較，DT、OR H/L組P53 mRNA表達(dá)下降(95％CI分別為[0.942，0.971]、[0.755，0.805]、[0.895，0.945])。與DT組比較，OR H/L組P53mRNA表達(dá)降低(P值分別為0.000，0.007)。
　　 雌性大鼠海馬組織AC組Rb mRNA表達(dá)與YC組比較升高(95％CI:[0.777，0.837])。

16、與AC組比較，DT、OR H/L組Rb mRNA表達(dá)下降(95％CI分別為[0.425，0.448]、[0.913，0.932]、[0.812，0.870])。與DT組比較，OR H/L組Rb mRNA表達(dá)升高(P值均為0.000)。
　　 雌性大鼠海馬組織AC組IGF mRNA表達(dá)與YC組比較升高(95％CI:[0.923，0.956])。與AC組比較，DT、OR H/L組IGF mRNA表達(dá)下降(95％CI值分別為[0.40

17、4，0.659]、[0.715，0.759]、[0.472，0.548])。與DT組比較，ORH/L組IGFmRNA表達(dá)無顯著性差異(P值分別為0.055，0.961)。
　　 雌性大鼠海馬組織AC組GLS mRNA表達(dá)與YC組比較降低(95％CI:[1.537，2.255])。與AC組比較，DT、OR H/L組GLS mRNA表達(dá)降低(95％CI分別為[0.700，0.738]、[0.755，0.782]、[0.599，0.6

18、41])。與DT組比較，OR H/L組GLSmRNA表達(dá)有顯著性差異(P值分別為0.005，0.001)。
　　 雌性大鼠海馬組織AC組Prdx-3 mRNA表達(dá)與YC組比較升高(95％CI:[0.763，0.832])。與AC組比較，DT、OR H/L組Prdx-3 mRNA表達(dá)降低(95％CI分別為[0.766，0.885]、[0.763，1.055]、[0.616，0.732])。與DT組比較，OR H組Prdx-3 mR

19、NA表達(dá)無顯著性差異(P=0.368)，OR L組有顯著性差異(P=0.006)。
　　 雌性大鼠海馬組織AC組Mn-SOD mRNA表達(dá)與YC組比較降低(95％CI:[1.861，2.522])。與AC組比較，DT組表達(dá)下降(95％CI:[0.535，0.580]);ORH/L組Mn-SOD mRNA表達(dá)升高(95％CI分別為:[1.313，1.463]、[2.340，2.484])。與DT組比較，OR H/L組Mn-SOD

20、mRNA表達(dá)升高(P值分別為0.001，0.000)。
　　 雌性大鼠海馬組織AC組GPX mRNA表達(dá)與YC組比較降低(95％CI:[1.886，1.952])。與AC組比較，DT、OR H/L組GPX mRNA表達(dá)升高(95％CI分別為[1.440，1.489]、[1.937，2.082]、[1.718，1.775])。與DT組比較，OR H/L組GPX mRNA表達(dá)升高(P值均為0.000)。
　　 雌性大鼠海馬組

21、織AC組BDNF mRNA表達(dá)與YC組比較降低(95％CI:[1.731，2.090])。與AC組比較，DT組表達(dá)降低(95％CI:[0.727，0.949]); OR H/L組BDNF mRNA表達(dá)升高(95％CI分別為[1.337，1.364]、[1.429，1.552])。與DT組比較，OR H/L組BDNF mRNA表達(dá)升高(P值分別為0.007，0.001)。
　　 雌性大鼠海馬組織AC組TrkB mRNA表達(dá)與YC組

22、比較降低(95％CI:[1.858，2.484])。與AC組比較，DT組表達(dá)無顯著性差異(95％CI:[0.854，1.004]);OR H/L組TrkB mRNA表達(dá)升高(95％CI分別為[1.474，1.861]、[1.345，1.531])。與DT組比較，OR H/L組TrkB mRNA表達(dá)升高(P值分別為0.005，0.000)。
　　 5.免疫組織化學(xué)結(jié)果:細(xì)胞DNA損害標(biāo)志物8-OHDG、促凋亡相關(guān)Bax、P19AR

23、F、增殖調(diào)控相關(guān)蛋白P21多為胞漿/胞質(zhì)表達(dá)，彌漫性、灶性分布均有。AC組8-OHDG、Bax、P19、P21陽性細(xì)胞積分光密度值與YC組比較升高(P值分別為0.000、0.000、0.024、0.004)。與AC組相比，DT組8-OHDG升高，Bax、P19、P21表達(dá)降低(P值分別為0.000、1.000、0.353、0.006);OR H組8-OHDG、Bax、P19、P21陽性細(xì)胞積分光密度值降低(P值分別為0.000、0.00

24、0、0.227、0.004); OR-L組8-OHDG、Bax、P19、P21表達(dá)降低(P值分別為0.000、0.000、0.166、0.007)。與DT組比較，OR H/L組8-OHDG、Bax表達(dá)降低(P值均為0.000);P19表達(dá)無顯著性差異(P值分別為0.999、0.819); OR H組P21表達(dá)降低(P=0.037)，OR L組P21表達(dá)無顯著性差異(P=0.409)。
　　 細(xì)胞抑制凋亡相關(guān)Bcl-2、腦源性神經(jīng)

25、因子BDNF多為胞漿/胞質(zhì)表達(dá)，彌漫性、灶性分布均有。AC組Bcl-2、BDNF陽性細(xì)胞積分光密度值與YC組比較降低，差異有顯著性（P值均為0.000）。與AC組相比，DT組Bcl-2、BDNF陽性細(xì)胞積分光密度值升高(P值分別為0.000、1.000);OR H組Bcl-2、BDNF陽性細(xì)胞積分光密度值升高(P值均為0.000);OR L組Bcl-2、BDNF陽性細(xì)胞積分光密度值升高(P值分別為0.000、0.003)。與DT組比較，

26、OR H/L組Bcl-2表達(dá)升高（P值均為0.000）、BDNF表達(dá)升高(P值分別為0.000、0.015)。
　　 6.免疫印跡結(jié)果:AC組海馬組織BDNF、TrkB、pRb表達(dá)與YC組相比均數(shù)低于后者(P值分別為0.012、0.000、0.025)，P19、P53表達(dá)高于后者(P值分別為0.013，0.004)。與AC組比較，DT組BDNF、TrkB、pRb蛋白表達(dá)無顯著性差異(P值分別為0.537、1.000、1.000)

27、，P19蛋白表達(dá)無顯著性差異(P=0.684)，P53蛋白表達(dá)升高(P=0.003);OR H組BDNF、TrkB、pRb蛋白表達(dá)升高（P值分別為0.001、0.000、0.001），P19蛋白表達(dá)無顯著性差異(P=0.463)，P53表達(dá)降低(P=0.003);OR L組BDNF、TrkB、pRb蛋白表達(dá)升高(P值分別為0.003、0.000、0.000)，P19蛋白表達(dá)無顯著性差異(P=0.601)，P53表達(dá)降低(P=0.010)

28、。與DT組比較，ORH組BDNF、TrkB、pRb表達(dá)升高（P值分別為0.013，0.000，0.035)，P53表達(dá)降低(P=0.002)，P19表達(dá)無顯著性差異(P=0.187); OR L組BDNF、TrkB、pRb表達(dá)升高(P值分別為0.049，0.000，0.026)，P53表達(dá)降低(P=0.006); P19表達(dá)無顯著性差異(P=0.219)。
　　 結(jié)論:
　　 1.哈蟆油可顯著延長果蠅生存時間。
　

29、　 2.哈蟆油可提高自然衰老雌性大鼠抗氧化能力，部分緩解氧化損傷，使海馬組織錐體細(xì)胞病理改變程度減輕。
　　 3.自然衰老雌性大鼠P21、P53、Rb、Bax表達(dá)升高，p-Rb、BDNF、TrkB、Bcl-2表達(dá)降低。給予哈蟆油治療后，P21、P53、Rb、Bax表達(dá)顯著降低，p-Rb、BDNF、TrkB、Bcl-2表達(dá)顯著升高。推測哈蟆油可能是通過抑制P21-Rb信號通路，增強(qiáng)BDNF-TrkB信號通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖，減輕細(xì)