溶血、脂肪血及保存條件對血液病毒核酸篩查影響的研究.pdf

1、目的:研究溶血、脂肪血、不同保存溫度和保存時間對血液HCV RNA、HIV RNA、HBV DNA核酸檢測（NAT）的影響，探索NAT檢測標(biāo)本在血液采集、處理及保存過程中的關(guān)鍵控制環(huán)節(jié)。
　　方法:1.采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），對2016年1月1日至2016年9月30日無償獻血者血液標(biāo)本41552人份進行檢測，篩查出HBsAg、抗-HCV、抗-HIV陽性和陰性的血液標(biāo)本；2.應(yīng)用羅氏MPX V2.0核酸檢測試劑盒對上述標(biāo)

2、本進行檢測，檢測模式為6人份標(biāo)本混樣檢測模式及拆分檢測模式（單人份標(biāo)本檢測），分別篩選出HCV RNA、HIV RNA、HBV DNA單陽性標(biāo)本，并制備成12-30倍試劑盒檢測下限(LOD)濃度的核酸陽性實驗標(biāo)本；3.將制備得到的核酸陽性實驗標(biāo)本分別放置于4℃、25℃、37℃、-30℃保存4h、24h、48h、72h、1w、4w（每個時間點各5份），對所有實驗標(biāo)本進行NAT檢測，并收集Ct值進行統(tǒng)計分析；4.收集科研用紅細胞懸液和嚴重乳

3、糜血漿，制備成倍比稀釋的溶血樣本（1、1/2、1/4、1/8、1/16）和用于Hb檢測的溶血標(biāo)準(zhǔn)樣本（1/2、1/6、1/12、1/24、1/48、1/96），以及倍比稀釋脂肪血樣本（1、1/2、1/4、1/8）和用于TG檢測的脂肪血標(biāo)準(zhǔn)樣本（1/2、1/6、1/12、1/24、1/48），分別采用氰化高鐵血紅蛋白（HiCN）法和甘油磷酸氧化酶法，測定溶血標(biāo)準(zhǔn)樣本血紅蛋白（Hb）濃度和脂肪血標(biāo)準(zhǔn)樣本甘油三脂（TG）濃度；使用Hamilt

4、on Microlab Star全自動混樣儀，將前述倍比稀釋溶血樣本和倍比稀釋脂肪血樣本按照實驗設(shè)計（見論文2.2.5-2.2.6部分），制備成核酸陽性溶血樣本（溶血程度同溶血標(biāo)準(zhǔn)樣本）、核酸陽性脂肪血樣本（脂肪血程度同脂肪血標(biāo)準(zhǔn)樣本），應(yīng)用羅氏 MPX V2.0核酸檢測試劑盒對制備成的核酸陽性溶血樣本、核酸陽性脂肪血樣本進行檢測，并對檢測Ct值進行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:1.41552份無償獻血者血液標(biāo)本中，ELISA篩檢出HBs

5、Ag陽性205例（0.49％）、抗-HCV陽性82例（0.20%）、抗-HIV陽性35例（0.08%）；2.3份單陽性病毒核酸濃度分別為：HBV DNA100IU/ml、HCV RNA2.7×107 IU/ml、HIV RNA9.6×104 IU/ml。3.在標(biāo)本保存時間和保存溫度實驗中，-30℃保存條件下保存4h至4w，HCV RNA、HIV RNA、HBV DNA檢測Ct值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.00333）（見表3.15、表3

6、.16、表3.17）。在4℃保存條件下，4h、24h、48h、72h組分別和1w及4w組相比，HCV RNA檢測Ct值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.00333）；而4℃4h、24h、48h、72h組間HCV RNA檢測Ct值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.00333）。25℃條件下，4h和72h組相比HCV RNA檢測Ct值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.00333），4h和1w組相比HCV RNA檢測Ct值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.00333）。

7、37℃保存條件下，4h與24h組相比HCV RNA檢測Ct值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.00333）。HIV RNA、HBV DNA在37℃以下保存條件保存1w檢測Ct值均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.00333）。在-30℃至37℃條件下保存4h，HCV RNA、HIV RNA、HBV DNA檢測Ct值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.00833）（見表3.18、表3.19、表3.20）。當(dāng)保存時間為24h，37℃組與-30℃和4℃組相比， HCV

8、RNA檢測 Ct值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（ P＜0.00833），但25℃組和4℃及37℃組相比HCV RNA檢測Ct值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.00833）。當(dāng)保存時間為72h時，-30℃組和37℃組相比HBV DNA檢測Ct值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.00833），其它各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.00833）；4.在溶血因素實驗中，Hb濃度為97g/L時HBV DNA和HIV RNA未能被檢出，但仍能檢測出HCV RNA（Ct

9、值：46.3±7.9）。當(dāng)Hb濃度為34g/L、17g/L、8g/L、5g/L、3g/L時，HBV DNA、HIV RNA檢測Ct值分別與其對照組檢測 Ct值相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Hb濃度≥8g/L時， HCV RNA檢測Ct值（46.3±7.9、37.5±0.4、37.3±0.3、37.6±0.5）分別與對照組檢測Ct值（36.4±0.2）相比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)Hb濃度≤5g/L時HCV RNA

10、檢測Ct值（36.4±0.6、36.2±0.5）與對照組Ct值（36.4±0.2）相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；5.在脂肪血因素實驗中，TG濃度≤7.93mmol/L時，HCV RNA、HIV RNA、HBV DNA應(yīng)用NAT檢測時均不受TG的影響，各組與對照組檢測Ct值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. TG濃度＜7.93mmol/L時對羅氏MPX V2.0試劑檢測HCV RNA、HIV