內(nèi)源性TGFβ1對(duì)肝星狀細(xì)胞IGFBPrPl表達(dá)的影響及意義.pdf

1、正常肝臟在各種慢性肝病損傷下,引起持續(xù)或反復(fù)的肝實(shí)質(zhì)炎癥壞死,使得纖維結(jié)締組織大量增生,而其降解相對(duì)不足,大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)沉積形成肝纖維化,進(jìn)一步進(jìn)展則導(dǎo)致肝硬化的發(fā)生。如果能給予有效的治療,則已經(jīng)形成的肝纖維化可以逆轉(zhuǎn)。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSC)由靜息態(tài)被激活是肝纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ),活化的HSC能合成和分泌ECM,導(dǎo)致ECM在肝內(nèi)過(guò)量沉

2、積。
　　 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子pi(transforming growth factor beta l,TGFpi)能夠促進(jìn)HSC轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維樣細(xì)胞,增加細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生,減少基質(zhì)的降減,并抑制肝細(xì)胞再生及誘導(dǎo)凋亡,在肝纖維化的發(fā)生中起到重要作用,被認(rèn)為是目前最強(qiáng)的致纖維化因子。
　　 胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白l(insulin-like growth factor binding protein related p

3、rotein 1,IGFBPrPI)是一種可溶性的分泌性蛋白質(zhì)。導(dǎo)師劉立新前期研究發(fā)現(xiàn),IGFBPrPI在肝纖維化和肝硬化患者肝組織中高表達(dá),并且與TGFpi的高表達(dá)和膠原合成的增多呈正相關(guān):外源性重組TGFpi作用于體外培養(yǎng)的HSC后,可使IGFBPrPI蛋白的產(chǎn)生增多;抗IGFBPrPI抗體可以抑制TAA誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝組織中TGFpi的產(chǎn)生。有研究表明,0.05-O.lμg/L濃度的外源性重組TGFβ1作用于兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞時(shí),

4、可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖,內(nèi)源性TGFpi基因在兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)后,細(xì)胞增殖受到抑制,提示不同來(lái)源的TGFβ1對(duì)同一細(xì)胞的生理作用會(huì)有不同的影響。為了明確內(nèi)源性TGFβ1對(duì)肝星狀細(xì)胞中IGFBPrPI表達(dá)的影響及其可能的意義,設(shè)計(jì)了本課題。
　　 目的：
　　 明確內(nèi)源性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)βl對(duì)肝星狀細(xì)胞中胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白I(IGFBPrPI)表達(dá)的影響及其可能的意義。
　　 方法：
　

5、　 1.轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)
　　 使用帶熒光的陰性質(zhì)粒pEGFP-NI轉(zhuǎn)染人肝星狀細(xì)胞LX-2后48h,熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。
　　 2.內(nèi)源性TGFpi基因過(guò)表達(dá)
　　 將LX-2分為3組:空白對(duì)照組:加入等量不含血清及抗生素的RPMl-1640培養(yǎng)液;陰性質(zhì)粒組:轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒;TGFpi過(guò)表達(dá)組:轉(zhuǎn)染TGFβl過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間(24h、48h、72h),采用Real-timePCR法檢測(cè)TGFβ

6、l、CollagenImRNA的表達(dá);轉(zhuǎn)染后72h,采用Westemblot法檢測(cè)細(xì)胞上清液中TGFβl、CollagenI蛋白的表達(dá)。
　　 3.內(nèi)源性TGFpi對(duì)IGFBPrP1表達(dá)的影響
　　 LX-2分組及處理同前,轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間(24h、48h、72h),采用Real-time PCR法檢測(cè)IGFBPrPImRNA的表達(dá);轉(zhuǎn)染后72h,采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞胞漿中IGFBPrPI蛋白的表達(dá)。

7、r>　　 結(jié)果：
　　 1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率
　　 轉(zhuǎn)染后48h,熒光顯微鏡下觀察,可見綠色熒光,說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功,計(jì)算質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率達(dá)40％。
　　 2.TGFpi、Collagenl mRNA及蛋白的表達(dá)
　　 Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染后24h,TGFβl過(guò)表達(dá)組(32.22±0.39)TGFpl mRNA的表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組(1)及陰性質(zhì)粒組(7.98±0.12),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

8、P＜O.OI),TGFpi過(guò)表達(dá)組(1.92±0.04)CollagenI mRNA的表達(dá)與陰性質(zhì)粒組(1.99±0.07)差別不明顯（P＞0.05）;轉(zhuǎn)染后48h,TGFβ1過(guò)表達(dá)組(63.12+0.44)TGFpi mRNA的表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組(1)及陰性質(zhì)粒組(l.Ol±0.01),TGFpi過(guò)表達(dá)組(2.00±0.06)CollagenI mRNA的表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組(l)及陰性質(zhì)粒組(1.02±0.01),差異均有統(tǒng)計(jì)

9、學(xué)意義（P值均＜0.01）;轉(zhuǎn)染后72h,TGFpi過(guò)表達(dá)組(38.46±0.19)TGFpi mRNA的表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組(1)及陰性質(zhì)粒組(1.05±0.01),TGFpi過(guò)表達(dá)組(8.63+0.15)CollagenI mRNA的表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組(1)及陰性質(zhì)粒組(1.03±0.02),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＜0.01)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染后72h,TGFβl過(guò)表達(dá)組(0.27±0.04)TG

10、Fpi蛋白的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組(0.20βO.OI)及陰性質(zhì)粒組(0.22β0.01),TGFpi過(guò)表達(dá)組(1.47±0.02)CollagenI蛋白的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組(0.76±0.03)及陰性質(zhì)粒組(0.77±0.02),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＜0.05)。
　　 3.IGFBPrPI mRNA及蛋白的表達(dá)
　　 Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染后24h,TGFpi過(guò)表達(dá)組(4.33±0.3

11、8)IGFBPrPI mRNA的表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組(l)及陰性質(zhì)粒組（2.86±0.09）;轉(zhuǎn)染后48h,TGFpi過(guò)表達(dá)組(1.4l±O.11)IGFBPrPI mRNA的表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組(1)及陰性質(zhì)粒組（1.07±0.16）;轉(zhuǎn)染后72h,TGFβl過(guò)表達(dá)組(2.56±0.30)IGFBPrPI mRNA的表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組(l)及陰性質(zhì)粒組(l.Oo±0.10),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＜0.Ol)。Wester

12、n blot檢測(cè)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染后72h,TGFpi過(guò)表達(dá)組(0.53±O.OI)IGFBPrPI蛋白的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組(0.25±0.02)及陰性質(zhì)粒組(0.27±0.03),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 內(nèi)源性TGFpi可引起LX-2過(guò)表達(dá)TGFβl和CollagenI mRNA及蛋白,同時(shí)亦可以增加IGFBPrPI mRNA及蛋白的表達(dá)。推測(cè)IGFBPrPI與致肝纖維化最強(qiáng)的因子TGF