奧曲肽降門脈壓及其空腸促吸收機制研究.pdf

1、乙型肝炎是肝硬化主要病因，我國乙肝患者及乙肝病毒感染者眾多，每年新發(fā)肝硬化者超過百萬。門脈高壓(portal hypertension，PH)是肝硬化失代償期患者典型的臨床表現(xiàn)，是肝硬化多種并發(fā)癥發(fā)生的根源及主要致死原因。對PH進行積極有效防治是改善患者預(yù)后及降低病死率的關(guān)鍵。
　　 血紅素氧合酶(heme oxygense，HO)/一氧化碳(carbon monoxide，CO)系統(tǒng)在肝硬化中晚期可加重PH程度，促多組織器官的

2、進行性病變，加速肝硬化進程，我們曾通過肝硬化PH大鼠研究模型得到了證實。但目前對HO/CO系統(tǒng)在肝硬化PH時期作用臨床研究較少，我們曾發(fā)現(xiàn)肝硬化PH患者血中可反映HO/CO系統(tǒng)水平的碳氧血紅蛋白指標升高，本研究擬通過臨床前瞻性研究進一步揭示該系統(tǒng)對PH患者伴多種并發(fā)癥及對各臟器作用影響。奧曲肽(Octreotide，OCT)是公認的理想降門脈壓藥物，但其降壓機制尚不清楚。因OCT可收縮內(nèi)臟血管，降門脈血流達降壓作用，而內(nèi)源性CO維持PH

3、的機理之一為擴張內(nèi)臟血管，故推測OCT可能通過影響HO/CO系統(tǒng)而起到降壓作用。本實驗對OCT通過HO/CO系統(tǒng)降門脈壓的可能機制進行探討，并進一步證實HO/CO系統(tǒng)的關(guān)鍵作用。
　　 由上述實驗并結(jié)合既往研究基礎(chǔ)證明了HO/CO系統(tǒng)在肝硬化PH發(fā)展過程中的重要意義，OCT可通過抑制該系統(tǒng)表達而起到降低門脈壓目的。結(jié)合OCT眾多藥物優(yōu)點，若能實現(xiàn)其口服降壓治療，有利于解決PH防治的難題。但蛋白多肽類物質(zhì)OCT，雖可抵抗胃腸道中酸

4、或酶降解，但分子量大，脂溶性差，受腸肝首過效應(yīng)及腸道吸收屏障影響，口服生物利用度極低。目前通過改變OCT的化學(xué)結(jié)構(gòu)或加入促吸收劑等方法，實驗結(jié)果均并不理想，且未研究PH病理情況下OCT吸收機制及促吸收研究。我們考慮直接研究影響OCT吸收的首過效應(yīng)的因素，可能更有利于發(fā)現(xiàn)OCT促吸收策略。因在PH狀態(tài)下門體靜脈分流形成，側(cè)支循環(huán)的建立及肝功異常等諸多因素，肝首過效應(yīng)對OCT口服吸收影響較小，而腸首過效應(yīng)影響可能更為顯著。我們通過對主要的腸

5、上皮轉(zhuǎn)運蛋白P-糖蛋白、多耐藥相關(guān)蛋白2和代謝酶細胞色素P4503A4進行研究，揭示OCT腸首過效應(yīng)機制，及探及在肝硬化PH情況下，上述轉(zhuǎn)運蛋白及代謝酶的變化對OCT腸道吸收影響，擬尋求實現(xiàn)OCT口服降壓策略。此外對PH狀態(tài)下寡肽類轉(zhuǎn)運蛋白PepT1對OCT的作用做了初步研究，尋求該病理狀態(tài)下的OCT直接轉(zhuǎn)運蛋白。
　　 本研究旨在通過基礎(chǔ)及臨床多角度揭示HO/CO系統(tǒng)在肝硬化PH時期重要作用，了解在該系統(tǒng)介導(dǎo)下的OCT降門脈壓

6、機制，并明確OCT腸道吸收障礙機理，為提高OCT口服生物利用度提供有效方法及途徑，有利于實現(xiàn)其口服降壓治療，同時為OCT臨床合理用藥提供理論依據(jù)。
　　 本研究共分三部分:
　　 第一部分血紅素氧合酶/一氧化碳系統(tǒng)介導(dǎo)的奧曲肽降門脈壓機制研究;
　　 第一節(jié)血紅素氧合酶/一氧化碳系統(tǒng)對門脈高壓并發(fā)癥的影響;
　　 第二節(jié)血紅素氧合酶/一氧化碳系統(tǒng)介導(dǎo)的奧曲肽降門脈壓機制探討;
　　 第二部分腸道轉(zhuǎn)

7、運蛋白及代謝酶對奧曲肽腸吸收的影響;
　　 第三部分肝硬化門脈高壓狀態(tài)下奧曲肽空腸促吸收及降門脈壓研究。
　　 第一部分血紅素氧合酶/一氧化碳系統(tǒng)介導(dǎo)的奧曲肽降門脈壓機制研究
　　 第一節(jié)血紅素氧合酶/一氧化碳系統(tǒng)對門脈高壓并發(fā)癥的影響
　　 目的:
　　 分析乙肝后肝硬化(hepatitis B virus-related cirrhosis，HBC)伴肝性腦病(hepatic encephal

8、opathy, HE)患者碳氧血紅蛋白(carboxyhemoglobin，COHb)水平及其在肝硬化常見門脈高壓(portal hypertension，PH)并發(fā)癥時的水平差異，并了解其與HE分期等的關(guān)系，揭示血紅素氧合酶(heme oxygenase，HO)/一氧化碳(carbon monoxide，CO)系統(tǒng)對PH患者伴多種并發(fā)癥及對各臟器的作用影響。
　　 方法:
　　 根據(jù)排除及診斷標準，68例入院治療的HB

9、C伴HE的大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院患者納入本研究入選標準（H組）;除外了重要器官異常的急診室患者（血氣分析等所有檢查數(shù)據(jù)均在正常范圍以內(nèi)）作為對照組（N組），共22例。
　　 收集患者臨床資料，進行相關(guān)檢查，收集COHb、氧分壓(partial pressure of oxygen，PaO2)、氧飽和度(oxygen saturation，SaO2)等檢測數(shù)據(jù)，對患者進行HE分期、食管胃底靜脈曲張、肝腎綜合征(hepatic r

10、enal syndrom，HRS)、自發(fā)性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis，SBP)、低氧血癥等診斷分析。比較HE患者COHb水平變化，伴不同PH并發(fā)癥時COHb水平差異及分析COHb水平與HE分期、PaO2及SaO2關(guān)系。
　　 結(jié)果:
　　 1.H組患者COHb水平較N組明顯升高（（2.102±1.021）％vs.（0.983±0.231）％，p=0.000)，COHb水平與

11、HE分期呈正相關(guān)(p=0.003，rs=0.358)。
　　 2.HE伴HRS患者COHb水平較未發(fā)生HRS者明顯降低((1.981±1.020)％vs.（2.502±1.073）％，p=0.029）;COHb水平在患者有無食管胃底靜脈曲張或SBP中無差異(p＞0.05)。
　　 3.HE患者COHb水平與PaO2呈負相關(guān)(P=0.006，r=-0.336)，與SaO2無關(guān)(P=0.576，r=-0.072)。HE患者達

12、到低氧血癥標準時，COHb水平升高（(2.72±0.362)％vs.(1.93±0.242)％,p=0.012)。
　　 結(jié)論:
　　 血紅素氧合酶/一氧化碳系統(tǒng)在肝硬化門脈高壓時期病理生理過程中起到重要作用，其表達具有組織特異性，對該時期患者具有重要臨床意義。
　　 第二節(jié)血紅素氧合酶/一氧化碳系統(tǒng)介導(dǎo)的奧曲肽降門脈壓機制探討
　　 目的:
　　 探討血紅素氧合酶(heme oxygense，H

13、O)/一氧化碳(carbon monoxide，CO)系統(tǒng)介導(dǎo)下的奧曲肽(Octreotide，OCT)降門脈壓機制，并進一步證實在肝硬化門脈高壓(portal hypertension，PH)階段HO/CO系統(tǒng)的關(guān)鍵作用。
　　 方法:
　　 將34只健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為3組，即假手術(shù)組（Sham組）10只，肝硬化門脈高壓組（PH組）12只及奧曲肽組（OCT組）12只。大鼠肝硬化PH模型

14、采用膽總管結(jié)扎方法。術(shù)后4周，OCT及PH組制模完成，前者予OCT腹腔注射（100μg/kg/d，日2次）3天，PH組及Sham組給予同等劑量的生理鹽水。給藥結(jié)束后，禁食水24h，對三組大鼠進行門靜脈壓力測定，后處死大鼠，取血、取肝，采用全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanineaminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平;HE染色對肝

15、臟進行病理形態(tài)學(xué)觀察;通過免疫組織化學(xué)、western blot及RT-PCR方法觀察大鼠肝臟HO-1蛋白及基因表達情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.對比ALT和AST值，PH組較Sham組明顯升高(P＜0.01); OCT組較PH組明顯下降(p＜0.01），但較Sham組升高(p＜0.05）。
　　 2.大鼠肝臟HE染色結(jié)果顯示PH組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，大量纖維組織增生，炎性細胞侵潤，見多個假小葉，小葉間膽管增生明顯

16、。OCT組纖維組織增生程度較PH組明顯減輕，炎細胞浸潤減少(p＜0.05），但較Sham組程度重(p＜0.05)。
　　 3.大鼠門脈壓力比較，PH組較Sham組明顯升高（（18.52±1.83）mmHg vs.（9.08±0.52）mmHg，p＜0.01）;OCT組（13.17±1.12 mmHg）較PH組明顯下降(p＜0.05)，但較SH組升高(p＜0.05)。
　　 4.免疫組織化學(xué)方法及western blot方

17、法結(jié)果顯示HO-1蛋白表達，PH組較Sham組增高(p＜0.01);OCT組表達較PH組顯著減少，但較Sham組高(p＜0.05)。應(yīng)用RT-PCR方法對上述HO-1蛋白表達結(jié)果在基因水平進行了驗證。
　　 結(jié)論:
　　 1.奧曲肽可抑制肝硬化門脈高壓時期血紅素氧合酶-1在肝臟的表達，其對血紅素氧合酶/一氧化碳系統(tǒng)進行調(diào)控可能是其降門脈壓機制之一。
　　 2.血紅素氧合酶/一氧化碳系統(tǒng)在門脈高壓形成中具有重要作用

18、。
　　 第二部分腸道轉(zhuǎn)運蛋白及代謝酶對奧曲肽腸吸收的影響
　　 目的:
　　 研究腸上皮轉(zhuǎn)運蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白2(multidrug resistance associated protein2，MRP2)及代謝酶細胞色素CYP4503A4(cytochrome P4503A4，CYP3A4)與奧曲肽(Octreotide，OCT)腸吸收關(guān)系，并了解在肝硬

19、化門脈高壓(portal hypertension，PH)狀態(tài)下，P-gp、MRP2及CYP3A4變化對OCT腸吸收作用影響。
　　 方法:
　　 1.運用Caco-2細胞轉(zhuǎn)運模型，分別給予OCT（10μM）及加入P-gp抑制劑羅丹明123(1mM)或MRP2抑制劑丙磺舒(1mM)后(n=4)，考察OCT在Caco-2細胞腸腔側(cè)(apical side，AP)和基底側(cè)(basolateral side，BL)雙向轉(zhuǎn)運的表

20、觀滲透系數(shù)(apparent permeability coefficient，Papp)及滲透方向率(permeability directionrate，PDR);考察OCT藥物濃度(1μM或50μM)對轉(zhuǎn)運的影響。
　　 2.建立膽管結(jié)扎肝硬化PH大鼠模型，運用離體翻轉(zhuǎn)腸實驗，考察P-gp抑制劑維拉帕米(1mM)及MRP2抑制劑丙磺舒(1mM)對漿膜側(cè)OCT濃度影響。正常大鼠分組(n=4):單獨予OCT（A組）;予維拉帕米

21、+OCT（B組）;予丙磺舒+OCT（C組）;予維拉帕米及丙磺舒+OCT（D組），OCT濃度10μM。PH大鼠分組同上，對應(yīng)設(shè)為A1組，B1組，C1組及D1組(n=4)。
　　 3.運用大鼠在體空腸灌流實驗，考察抑制劑對血中OCT濃度影響情況。正常大鼠分組(n=4):予OCT（A組）;予P-gp抑制劑維拉帕米+OCT（B組）;予丙磺舒+OCT（C組）;同時予維拉帕米及丙磺舒（D組）。PH大鼠分組同上，對應(yīng)分組為A1組，B1組，C1

22、組及D1組。給藥濃度同翻轉(zhuǎn)腸實驗。
　　 4.制備正常及PH大鼠腸微粒體，考察CYP3A抑制劑酮康唑?qū)CT代謝影響。
　　 正常大鼠微粒體實驗分組(n=6):予OCT（N+OCT組），予OCT+酮康唑(N+OCT+K組);PH大鼠微粒體實驗分組同正常大鼠，對應(yīng)地設(shè)為PH+OCT組，PH+OCT+K組;對照組:未加微粒體，僅予OCT孵育（OCT組）。OCT濃度100μM，酮康唑濃度10μM。
　　 5.人CYP3

23、A4重組酶實驗，在2.5mg/mL重組微粒體酶中加入OCL(100mM)，考察不同孵育時間對OCT代謝影響，選擇最佳孵育時間。孵育10min，考察不同CYP3A4蛋白濃度(1.25，2.5，5，10，20mg/mL)對OCT(100mM)代謝影響，選擇最佳重組酶的蛋白濃度。根據(jù)最適重組酶的蛋白濃度和最適反應(yīng)時間，將不同濃度OCT(20，50，100，200，400 mM)加入孵育體系中，檢測剩余OCT濃度，考察孵育體系中是否有代謝物生成

24、。
　　 結(jié)果:
　　 1.OCT在Caco-2細胞轉(zhuǎn)運無濃度依賴性，10μM是考察P-gp、MRP2主動轉(zhuǎn)運最適宜濃度，分別單獨予P-gp和MRP2抑制劑，PDR均＞1.5。正常組Papp(B-A)較Papp(A-B)明顯升高(p＜0.05)，予P-gp及MRP2抑制劑后，抑制劑組Papp(A-B)均高于Papp(B-A)(p＜0.05);各抑制劑組Papp(A-B)較正常組明顯升高，在兩種抑制劑聯(lián)用情況下升高更為顯著

25、(p＜0.01);合用兩種抑制劑，Papp(A-B)高于單用一種抑制劑組(p＜0.05)，且Papp(B-A)低于正常組(p＜0.01)。
　　 2.離體翻轉(zhuǎn)腸實驗，對比OCT濃度，D組在三組中最高(p＜0.05），B組較C組升高(p＜0.05），PH大鼠離體翻轉(zhuǎn)腸實驗提示上述相同結(jié)果，且PH大鼠各組OCT濃度較相應(yīng)正常大鼠各組下降(p＜0.05）。正常大鼠B，C和D組AUC值分別是A組的176.22％，151.39％和220.

26、63％。PH大鼠B1，C1和D1組AUC值分別是A1組的151.82％，128.23％，和165.33％。A1組的AUC值是A組的21.54％。
　　 3.在體空腸灌流實驗，對比OCT濃度，D組較其他三組升高(p＜0.05），B組較C組升高(p＜0.05），PH大鼠實驗結(jié)果與之相同，且PH大鼠各組OCT濃度較相應(yīng)正常大鼠各組下降(p＜0.05）。B，C和D組AUC值分別是組A的521.08％，418.95％和618.40％。B1

27、，C1和D1組AUC值分別是組A1的384.61％，236.28％和461.78％。A1組的AUC值是A組的96％。
　　 4.腸微粒體實驗，PH+OCT組OCT濃度低于N+OCT組(p＜0.05）;予抑制劑酮康唑后，OCT濃度顯著升高(N+OCT組＜N+OCT+K組，PH+OCT組＜PH+OCT+K組，p＜0.01)。OCT組OCT濃度較N+OCT組及PH+OCT組升高(p＜0.01)，但較N+OCT+K組及PH+OCT+K組

28、均無明顯差異(p＞0.05）。
　　 5.人重組CYP3A4酶實驗，最佳孵育時間為10min，最佳重組酶CYP3A4蛋白濃度為2.5mg/mL。隨著體系中加入OCT濃度降低，殘余OCT量減少，孵育體系中可檢測到小分子OCT代謝產(chǎn)物。
　　 結(jié)論:
　　 奧曲肽是腸上皮轉(zhuǎn)運蛋白P-糖蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白2及代謝酶細胞色素CYP4503A4的底物，三者具有明顯抑制奧曲肽腸吸收效應(yīng)。在肝硬化門脈高壓病理狀態(tài)下，上述轉(zhuǎn)

29、運蛋白及代謝酶表達或活性升高，對OCT腸吸收的抑制作用更為顯著。
　　 第三部分肝硬化門脈高壓狀態(tài)下奧曲肽空腸促吸收及降門脈壓研究
　　 目的:
　　 考察應(yīng)用腸上皮轉(zhuǎn)運蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白2(multidrug resistance associated protein2，MRP2)及代謝酶細胞色素CYP4503A4(cytochrome P4503A4，C

30、YP3A4)抑制劑后對門脈高壓(portal hypertension，PH)大鼠奧曲肽(Octreotide，OCT)腸吸收影響及降門脈壓效果測定;了解PH狀態(tài)下，寡肽轉(zhuǎn)運蛋白PepT1變化對OCT腸吸收影響，期待尋求實現(xiàn)OCT口服用藥的有效方法。
　　 方法:
　　 1.建立膽管結(jié)扎肝硬化PH大鼠模型，進行在體吸收實驗，觀察加入P-gp，MRP2及CYP3A抑制劑后，大鼠腸吸收效果變化。正常大鼠分2組(n=4):OC

31、T靜脈給藥及OCT十二指腸給藥組;PH大鼠分組:OCT靜脈給藥組，OCT十二指腸給藥組及OCT聯(lián)合抑制劑（維拉帕米4.9mg/kg，丙磺舒300mg/kg，酮康唑5.3mg/kg）十二指腸給藥組(n=4)。OCT十二指腸給藥劑量1mg/kg，靜脈給藥劑量0.1mg/kg。給藥后不同時間點于頸靜脈取血，計算藥代動力學(xué)參數(shù)。
　　 2.正常大鼠分為2組，未加藥物組（N組），予OCT組（N+OCT組）;PH大鼠分3組，無藥物組（PH組

32、），予OCT組（PH+OCT組），及OCT+混合抑制劑組（抑制劑劑量同上），OCT給藥劑量1mg/kg，日1次，連續(xù)給藥3天，處死大鼠，取空腸，用western blot、免疫組化及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)方法觀察各組大鼠空腸上皮P-gp，MRP2及CYP3A4蛋白和基因的表達。
　　 3.測壓實驗:正常大鼠不給藥（N組），

33、PH大鼠分為無藥物組（PH組），OCT組（PH+OCT組）及OCT+混合抑制劑（抑制劑劑量同上）組(PH+OCT+Ⅰ組)(n=4)，
　　 OCT給藥劑量為1mg/kg，日1次，連續(xù)3天灌胃給藥后，測定門靜脈壓力。
　　 4.對PH狀態(tài)下，PepT1對OCT轉(zhuǎn)運效果考察。正常大鼠分不給藥組（N組），及OCT給藥組(N+OCT組)，PH大鼠分組相同，設(shè)為PH及PH+OCT組(n=4)，OCT給藥劑量為1mg/kg，日1次，

34、連續(xù)灌胃給藥3天，處死大鼠，取空腸，通過westernblot、免疫組化及RT-PCR方法觀察各組大鼠PepT1蛋白及基因表達情況。運用Caco-2細胞轉(zhuǎn)運模型，考察PepT1抑制劑甘氨酰肌氨酸(glycylsarcosine，Gly-Sar)(1mM)對OCT(10μM)在腸腔側(cè)（apical side，AP）和基底側(cè)(basolateral side，BL)雙向轉(zhuǎn)運的表觀滲透系數(shù)（apparent permeability coef

35、ficient, Papp）及滲透率(permeability direction rate, PDR)。建立離體翻轉(zhuǎn)腸模型(n=4)，正常大鼠分為給予OCT(10μM)組（N組）及OCT+Gly-Sar(1mM)組（N+G組），PH大鼠給藥及分組相同，設(shè)為PH及PH+G組。建立大鼠空腸灌流模型，分組及給藥同翻轉(zhuǎn)腸實驗。
　　 結(jié)果:
　　 1.大鼠在體吸收實驗，靜脈注射后OCT濃度從血漿中快速清除，t1/2較短，正常大

36、鼠Vd、AUC較PH大鼠升高，表明藥物清除緩慢。空腸輸注OCT后，PH大鼠較正常大鼠Tmax延長，Cmax和AUC(0-12h)下降。OCT聯(lián)合P-gp/MRP2/CYP3A混合抑制劑后Tmax減少，同時Cmax，AUC(0-12h)較正常大鼠及未應(yīng)用抑制劑的PH大鼠明顯升高，F(xiàn)及ER約是未應(yīng)用抑制劑的PH大鼠的4倍。
　　 2.western blot、免疫組化結(jié)果均發(fā)現(xiàn)PH組P-gp，MRP2和CYP3A4蛋白均較N組升高(

37、p＜0.05），予OCT后顯著升高(N+OCT組＞N組，PH+OCT組＞PH組，p＜0.05)，予OCT聯(lián)合混合抑制劑后蛋白表達最少(p＜0.01)，N+OCT組和PH組表達無差異(p＞0.05)。RT-PCR方法見基因表達與蛋白表達結(jié)果一致。
　　 3.考察混合抑制劑對大鼠門脈壓力影響發(fā)現(xiàn)，PH組大鼠平均門脈壓力較正常組((15.56±2.36 mmHg) vs.(9.24±0.76 mmHg)明顯升高(p＜0.01)，且高于

38、PH+OCT組(12.51±1.50 mmHg，p＜0.05)。PH+OCT+Ⅰ組門脈壓力(6.95±1.12 mmHg)較PH組及PH+OCT組明顯下降(p＜0.01)，在正常范圍內(nèi)。
　　 4.考察PepT1與OCT腸吸收關(guān)系，免疫組化及western blot檢測發(fā)現(xiàn)對比PepT1蛋，PH組較N組表達升高(p＜0.05)，應(yīng)用OCT組較未應(yīng)用組無差異(N+OCT組vs.N組，PH+OCT組vs.PH組，p＞0.05)， P

39、H+OCT組高于N+OCT組(p＜0.01)。RT-PCR基因檢測結(jié)果與蛋白表達結(jié)果一致。Caco-2細胞研究發(fā)現(xiàn)，Gly-Sar抑制PepT1后，Papp(A-B)較Papp(B-A)仍明顯降低，無升高趨勢，且PDR＜1.5，故表明PepT1不能介導(dǎo)OCT在Caco-2細胞的主動轉(zhuǎn)運。翻轉(zhuǎn)腸實驗見較N組，N+OCT組漿膜腔中OCT濃度無明顯差異，在PH大鼠中，亦無明顯改變(p＞0.05)。PH大鼠各組OCT濃度較相應(yīng)正常大鼠各組下降(

40、p＜0.05），PH組是N組的52.4％。在體空腸灌流模型，OCT濃度在N組和N+G組中無差異，在PH組和PH+G組中亦無差異(p＞0.05)。PH大鼠各組OCT濃度較相應(yīng)正常大鼠各組下降(p＜0.05），PH組是N組的62.7％。
　　 結(jié)論:
　　 1.P-糖蛋白，多藥耐藥相關(guān)蛋白2及細胞色素CYP4503A4在奧曲肽腸吸收中具有重要作用，對其進行抑制可以明顯促肝硬化門脈高壓大鼠腸吸收，降壓效果理想。