奧曲肽對(duì)胃癌細(xì)胞Akt及ZAC的效應(yīng).pdf

1、胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞中的D細(xì)胞可分泌生長(zhǎng)抑素(somatostatin,SST),SST在人體內(nèi)有兩種生物活性形式:SST-14和SST-28,它們分別由14和28個(gè)氨基酸構(gòu)成。這種環(huán)形的小肽由較大的前體分子前原SST及原SST水解而成。SST抑制胰酶分泌和膽汁分泌,還抑制內(nèi)分泌激素如分泌素、胰島素、胰高血糖素和血管活性腸肽的分泌。SST不僅能夠調(diào)控神經(jīng)傳遞和激素的分泌,還對(duì)正常組織以及腫瘤的細(xì)胞增殖有一定的調(diào)節(jié)作用。生長(zhǎng)抑素受體(soma

2、tostatin receptor,SSTR)屬于G蛋白耦聯(lián)受體(Gprotein-coupled receptor,GPCR),包括SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4和SSTR5。SST及其類似物主要是通過與細(xì)胞表面的SSTR相互作用,繼而活化受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮其效應(yīng)。Akt是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,是由akt1和akt2基因的編碼產(chǎn)物,與病毒癌基因v-akt高度同源。由于Akt與PKA、PKC家族有同源性,因此也被

3、稱為PKB。Akt在對(duì)生長(zhǎng)因子效應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起重要作用,能夠調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)錄和營(yíng)養(yǎng)代謝。Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑被抑制之后,可引起腫瘤細(xì)胞的凋亡和生長(zhǎng)抑制。SST類似物可抑制Akt活性,并且可顯著抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。介導(dǎo)SST抗增殖效應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子以及靶基因的研究很少。調(diào)控凋亡和細(xì)胞周期阻滯的鋅指蛋白(zinc finger protein which regulates apoptosis and cell cycle

4、 arrest,ZAC)為一種轉(zhuǎn)錄因子,在人體內(nèi)廣泛表達(dá),具有轉(zhuǎn)錄活化活性和DNA結(jié)合功能。ZAC可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞G1期阻滯,從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。2006年,Theodoropoulou等發(fā)現(xiàn)在腦垂體瘤細(xì)胞中,SST類似物奧曲肽(octreotide,OCT)是通過Akt途徑誘導(dǎo)ZAC的表達(dá)而發(fā)揮其抗增殖作用的。胃癌細(xì)胞系中,SST是否通過Akt途徑影響ZAC的表達(dá),導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制,尚未見報(bào)道。
　　本研究應(yīng)用RT-

5、PCR技術(shù)觀察胃癌細(xì)胞系SGC-7901和BGC-823中SSTR亞型的表達(dá),為選擇合適的SST類似物提供依據(jù);應(yīng)用Westernblot技術(shù)觀察SST類似物OCT對(duì)胃癌細(xì)胞系SGC-7901和BGC-823Akt、磷酸化Akt(phosphoyrlated Akt,p-Akt)和ZAC的效應(yīng),探討胃癌細(xì)胞中SST介導(dǎo)其抗增殖效應(yīng)的可能機(jī)制。
　　材料與方法:1.材料胃癌細(xì)胞系SGC-7901和BGC-823(本教研室保存)常規(guī)培

6、養(yǎng)于含10％FBS、100KU/L青霉素及100KU/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37℃、5％的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。提取胃癌細(xì)胞系總RNA用于RT-PCR,檢測(cè)SSTR mRNA的表達(dá)。2.RT-PCR引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。SSTR1:上游,AGCCGGTTGACTATTACGCC,下游,GCTCTCACTTCTACCATTGTC;SSTR2:上游,GGTGAAGTCCTCTGGAATCC,下游,CCATT

7、GCCAGTAGACAGAGC;SSTR3:上游,TCATCTGCCTCTGCTACCTG,下游,GAGCCCAAAGAAGGCAGGCT;SSTR4:上游,CGGCAGTCTTCGTGGTCTAC,下游,GCATCAAG-GCTGGTCACGAC;SSTR5:上游,AACACGCTGGTCATCTACGTGGT,下游,AGACACTGGTGAACTGGTTGAC。采用一步法進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),反應(yīng)條件如下:94℃30 s;60℃,1

8、min;68℃,2min;40個(gè)循環(huán)。68℃,7min;4℃,0s。1.5％瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。3.MTT胃癌細(xì)胞系BGC-823和SGC7-901分別以終濃度為1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L和1000nmol/L OCT處理24h。以MTT法檢測(cè)OCT對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng),篩選有效濃度。4.以10nmol/L OCT處理胃癌細(xì)胞系,24h后收集細(xì)胞。提取細(xì)胞總蛋白用于Western blot檢測(cè)Akt和p

9、-Akt的水平;提取核蛋白用于Western blot檢測(cè)ZAC的水平。5.Western blot以化學(xué)發(fā)光試劑盒顯示W(wǎng)estern blot信號(hào)。β-actin為內(nèi)參。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,以P<0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果:1.RT-PCR結(jié)果SSTR1~SSTR5的RT-PCR產(chǎn)物分別為334bp、461bp、221bp、247bp和211bp。β-actin的RT-PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

10、為385bp。胃癌細(xì)胞系BGC-823和SGC-7901均可檢測(cè)到SSTR1、SSTR2、SSTR4和SSTR5 mRNA,未檢測(cè)到SSTR3 mRNA。2.MTT法結(jié)果10nmol/L OCT對(duì)胃癌細(xì)胞系BGC-823和SGC-7901的生長(zhǎng)抑制率分別為23.98％和52.96％,與100nmol/L LOCT的抑制效率19.41％和46.93％相似,故選10nmol/L OCT為有效抑制濃度。3.Western blot結(jié)果10nm